CRISPR實驗遞送體系的選擇

• Q1. CRISPR/Cas9如何修飾真核基因組？

  針對目標序列設計的gRNA與Cas9結合，并將Cas9引導到目標序列，目標序列的PAM序列上游3-4個堿基處，Cas9切割產生雙鏈斷裂（DSB）。

  兩種方法可以修復雙鏈斷裂：1. 如果不提供修復模板或供體DNA，則會通過易出錯的非同源末端連接 (NHEJ) 進行重新鏈接，產生插入缺失從而敲除蛋白質。2. 如果提供修復模板或供體DNA，則會通過同源重組(HDR)方式修復雙鏈斷裂，以準確敲入目標基因。

  
• Q2. CRISPR實驗如何選遞送體系？

  易轉染的細胞系可以選擇質粒，轉染效率低的細胞系建議選擇病毒，期望達到編輯效率更高、毒性更低的效果可以選擇RNP（即sgRNA+Cas9蛋白）的遞送系統。

• Q3. 質粒遞送體系中，all-in-one載體和雙載體如何選擇？

  All-in-one載體系統有兩個主要優點：

  • 只需轉染一次宿主細胞
  • 以1:1的比例進行gRNA和Cas9的導入

  雙載體中，Cas9和gRNA在不同的載體上獨立表達。如果您計劃表達多個gRNA以進行多重靶向，雙載體會更合適。對于這些應用，Cas9應首先在細胞系中穩定表達，然后可以用不同的gRNA載體轉染細胞以構建細胞庫。

• Q4. 什么時候需要慢病毒或腺相關病毒（AAV）載體？

  CRISPR 基因編輯的載體選擇應考慮應用和細胞類型。

  • 在大多數易于轉染的細胞系中，非病毒載體可以發揮很好的作用。
  • 慢病毒轉染可以用在瞬時轉染效率低的細胞中，例如原代細胞培養物或難以轉染的細胞系。
  • AAV載體具有低免疫原性，是體內基因傳遞的較佳選擇。由于AAV載體的載量限制通常小于其他載體（<5 kb），將SpCas9基因包裝到這些載體中可能具有挑戰性。金黃色葡萄球菌Cas9（SaCas9）比SpCas9小，是AAV載體的首選Cas9。
• Q5. 直接導入Cas9蛋白效果比用質粒DNA編碼Cas9蛋白更好嗎？

  直接使用Cas9蛋白或RNP的優勢有：

  • 提高編輯效率：RNP中Cas9蛋白與sgRNA復合物結合率更高、更穩定；
  • 降低脫靶效應：質粒表達和消除可能受非預期因素干擾，而RNP中Cas9蛋白與sgRNA是非持續表達，結合后轉導入宿主細胞，避免切割非靶序列；
  • 無DNA干擾：質粒本質是DNA，DNA可能隨機插入宿主DNA的斷裂處；
  • 無免疫原性：Cas9蛋白較之質粒，不易引起宿主細胞免疫反應，避免細胞因子等干擾；
  • 簡便快捷：RNP轉導后即可進行基因編輯，1天后可檢測到編輯效率，自動降解。

CRISPR實驗關鍵試劑的選擇

• Q6. 化學合成的sgRNA與利用體外轉錄（IVT）sgRNA有什么區別？

  化學合成sgRNA主要有以下優勢：

  • 編輯效率高：金斯瑞研發和Nat. Biotechnol等文獻均發現化學合成sgRNA的編輯效率高于體外轉錄sgRNA；
  • 細胞毒性低：體外轉錄sgRNA帶有5'三磷酸修飾，會引起細胞免疫反應，造成細胞毒性，干擾后續實驗，而化學合成的sgRNA則不存在該干擾因素；
  • 更穩定：化學合成sgRNA可添加硫代和甲氧基修飾，使其在儲存和試驗中更穩定，且化學合成工藝的穩定性和一致性優于生物合成，可以保證下游實驗的可重復性；
  • 操作簡單：化學合成sgRNA即買即用，體外轉錄sgRNA需要2-3天、5-6步合成操作，經濟和時間成本高。
• Q7. 使用合成sgRNA與使用crRNA:tracrRNA雙鏈體有什么不同？

  使用sgRNA時，無需在使用前對crRNA和tracrRNA雙鏈體進行退火。更重要的是，幾項研究表明，當與Cas9共同作用時，長單鏈sgRNA比crRNA：tracrRNA具有更好的穩定性，從而有更高的編輯效率^{1, 2}。

  1. Hendel, et al., Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat. Biotechnol., 33 (2015) 985-989.
  2. Ryan et al., Improving CRISPR–Cas specificity with chemical modifications in single-guide RNAs. Nucleic Acids Research, 46 (2018) 2: 792–803.
• Q8. gRNA序列應該如何設計？

  設計您的gRNA序列包括4個步驟：

  1. 確定目標基因位點。
  2. 尋找適合gRNA靶向的序列。
  3. 檢查脫靶結合的可能性。
  4. 選擇位于結合區域內的gRNA序列。

  通過提供脫靶評分和染色體位置，金斯瑞的gRNA數據庫和在線設計工具將消除您在選擇gRNA序列時的疑慮，建議使用3個gRNA序列，以確保敲除和實驗準確性。

• Q9. 進行CRISPR介導的基因KI時，如何從各種HDR模板中進行選擇？我應該選擇雙鏈DNA、質粒DNA還是單鏈DNA？

  這取決于實驗目的和宿主細胞類型。與雙鏈DNA供體相比，單鏈DNA表現出顯著提高編輯效率和特異性，以及減少脫靶整合的優勢，尤其是在編輯原代細胞、干細胞和開發轉基因動物模型方面。

  	質粒DNA	dsDNA	ssDNA
  敲入效率	中等	高	高
  脫靶效應	中等	高	低
  細胞毒性	高	高	低
  成本	低	中等	較高

• Q5. 金斯瑞為單鏈DNA模板提供哪些質量控制檢測？
  1. Sanger測序，以確保單鏈DNA序列的準確性；
  2. 通過凝膠電泳對最終單鏈DNA產品進行純度測試。

  在單鏈DNA的生產過程中，我們進行了兩輪測序，以保證序列的準確性。我們首先通過測序選擇經過序列驗證的質粒DNA模板，以確保最終單鏈DNA產品的純度和序列準確性。此外，我們對最終的單鏈DNA產品使用直接測序來確認單鏈DNA產品的序列正確性。最終的單鏈DNA產品僅包含全長、經過序列驗證的單鏈DNA分子。通過使用我們專有的、正在申請專利的酶合成方法，金斯瑞提供的單鏈DNA產品不含雙鏈DNA。

脫靶效應的檢測與規避方案

• Q11. 影響CRISPR靶向性效率和特異性的因素有哪些？

  影響CRISPR靶向效率和特異性的因素有：

  • gRNA設計：金斯瑞開發的gRNA設計軟件基于NCBI權威文獻開發和驗證的算法，選擇合適目標序列以避免脫靶效應，該算法在目標基因中尋找一個約20bp的序列，在其他位置沒有出現與其高度相似的序列。因為gRNA和非目標的內源基因組之間的錯配數小于3個時，可能發生Cas9介導的脫靶效應。
  • 核酸酶/靶向策略：大多數研究使用從化膿性鏈球菌中分離的Cas9核酸酶。Cas9 WT誘導雙鏈斷裂，通常通過非同源末端連接（NHEJ）修復，這會引入導致移碼和蛋白質表達完全喪失的小段基因嵌入或缺失，這已被證明是在每個細胞系和生物體中引入表型敲除的一種簡單有效的方法。另一種策略是使用這種酶的突變體Cas9-D10A（切口酶），它可用于在目的區域兩側誘導兩條單鏈斷裂，以進行更特異的敲除。如果您需要用于不同酶的gRNA序列，或者您對CRISPR靶向策略有其他特殊要求，請發送郵件至oligo@genscript.com.cn咨詢。
  • gRNA序列的數量：通常單個gRNA足以敲除目標基因；但是，我們建議您為每個目標基因訂購三個序列的gRNA，以提高基因組編輯的成功率，避免出現脫靶效應。

  在金斯瑞訂購 gRNA質粒，我們會提供一個經過序列驗證的質粒，其中包含gRNA表達和基因組結合所需的所有元素：U6啟動子、間隔（目標）序列、gRNA骨架和終止子。我們保證提供的gRNA克隆序列準確；然而，鑒于構建基因組編輯細胞系以及轉染和實驗的復雜性，我們無法保證使用我們的gRNA進行實驗的結果。如果您希望使用CRISPR技術創建經過序列驗證的KO或KI細胞系，請參閱GenCRISPR?基因編輯細胞系服務。

• Q12. 如何降低脫靶效應？

  降低脫靶效應的方法：

  1. 選擇特異的gRNA；
  2. 使用RNP；
  3. 使用eSpCas9；
  4. 使用Nickase Cas9；
• Q13. 如何檢測是否發生脫靶？

  基因編輯的脫靶率檢測一般有兩種方法：

  1. 選擇潛在的脫靶位點，例如選擇gRNA預測網站上Top 5潛在脫靶位點，進行Sanger測序單克隆；
  2. 預算允許的情況下，通過全基因組測序的方法進行全基因組序列的分析和比對更精準，例如基于NGS的iGUIDE方法。

CRISPR實驗的技巧

• Q14. 轉染或導入效率低怎么優化？

  一般來說主要通過以下方法：

  • 測試不同的轉染試劑，如不同廠家的Lipo產品；
  • 測試不同的電轉條件，如不同的電壓或者電轉buffer；
  • 測試不同的病毒感染條件，比如不同MOI，不同的Polybrene濃度。
• Q15. 設計有效的單鏈DNA模板有哪些技巧？

  對于點突變，建議使用非對稱單鏈DNA設計。對于大片段基因插入，有報道顯示插入基因側翼長度可從300到1000bp。在大多數情況下，500bp長度的同源臂就可以了。需要注意的是設計需要包含沉默突變的ssDNA模板，使sgRNA PAM序列發生突變，以避免二次切割。KI供體設計可能很復雜。強烈建議使用軟件（例如 snapgene）來查看和編輯序列。您可以閱讀以下文章以獲取更多設計技巧。

  Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology.

• Q16. 提高CRISPR KI效率的小技巧
  1. sgRNA切割位點應靠近突變位點，一般情況，15bp 之內編輯效果較好。
  2. 在轉染gRNA/Cas9和供體模板之前優化轉染效率。
  3. 使用FACS篩選轉染的細胞。
  4. 如果允許的話，使用藥物或標記來選擇 KI 克隆（例如，在插入基因的 C 端標記嘌呤霉素抗性基因以進行選擇）。

相關FAQ