FAQ: 脫靶效應(yīng)的檢測與規(guī)避方案
Q11. 影響CRISPR靶向性效率和特異性的因素有哪些？
影響CRISPR靶向效率和特異性的因素有：
- gRNA設(shè)計(jì)：金斯瑞開發(fā)的gRNA設(shè)計(jì)軟件基于NCBI權(quán)威文獻(xiàn)開發(fā)和驗(yàn)證的算法，選擇合適目標(biāo)序列以避免脫靶效應(yīng)，該算法在目標(biāo)基因中尋找一個(gè)約20bp的序列，在其他位置沒有出現(xiàn)與其高度相似的序列。因?yàn)間RNA和非目標(biāo)的內(nèi)源基因組之間的錯(cuò)配數(shù)小于3個(gè)時(shí)，可能發(fā)生Cas9介導(dǎo)的脫靶效應(yīng)。
- 核酸酶/靶向策略：大多數(shù)研究使用從化膿性鏈球菌中分離的Cas9核酸酶。Cas9 WT 誘導(dǎo)雙鏈斷裂，通常通過非同源末端連接 (NHEJ) 修復(fù)，這會(huì)引入導(dǎo)致移碼和蛋白質(zhì)表達(dá)完全喪失的小段基因嵌入或缺失，這已被證明是在每個(gè)細(xì)胞系和生物體中引入表型敲除的一種簡單有效的方法。另一種策略是使用這種酶的突變體Cas9-D10A(切口酶)，它可用于在目的區(qū)域兩側(cè)誘導(dǎo)兩條單鏈斷裂，以進(jìn)行更特異的敲除。如果您需要用于不同酶的gRNA序列，或者您對(duì)CRISPR靶向策略有其他特殊要求，請(qǐng)發(fā)送郵件至oligo@genscript.com.cn咨詢。
- gRNA序列的數(shù)量：通常單個(gè) gRNA 足以敲除目標(biāo)基因；但是，我們建議您為每個(gè)目標(biāo)基因訂購三個(gè)序列的gRNA，以提高基因組編輯的成功率，避免出現(xiàn)脫靶效應(yīng)。
在金斯瑞訂購 gRNA質(zhì)粒 ，我們會(huì)提供一個(gè)經(jīng)過序列驗(yàn)證的質(zhì)粒，其中包含gRNA表達(dá)和基因組結(jié)合所需的所有元素：U6啟動(dòng)子、間隔（目標(biāo)）序列、gRNA骨架和終止子。我們保證提供的gRNA克隆序列準(zhǔn)確；然而，鑒于構(gòu)建基因組編輯細(xì)胞系以及轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性，我們無法保證使用我們的gRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。如果您希望使用CRISPR技術(shù)創(chuàng)建經(jīng)過序列驗(yàn)證的 KO或KI細(xì)胞系，請(qǐng)參閱GenCRISPR™基因編輯細(xì)胞系服務(wù)。
Q12. 如何降低脫靶效應(yīng)？
降低脫靶效應(yīng)的方法：
- 選擇特異的gRNA；
- 使用RNP；
- 使用eSpCas9的質(zhì)粒；
- 使用Nickase Cas9。
Q13. 如何檢測是否發(fā)生脫靶？
基因編輯的脫靶率檢測一般有兩種方法：
- 選擇潛在的脫靶位點(diǎn)，例如選擇gRNA預(yù)測網(wǎng)站上Top 5潛在脫靶位點(diǎn)，進(jìn)行Sanger測序單克隆；
- 預(yù)算允許的情況下，通過全基因組測序的方法進(jìn)行全基因組序列的分析和比對(duì)更精準(zhǔn)，例如基于NGS的iGUIDE方法。
