FAQ: CRISPR實驗的技巧
Q14. 轉染或導入效率低怎么優化？
一般來說主要通過以下方法：
- 測試不同的轉染試劑，如不同廠家的Lipo產品；
- 測試不同的電轉條件，如不同的電壓或者電轉buffer；
- 測試不同的病毒感染條件，比如不同MOI，不同的Polybrene濃度。
Q15. 設計有效的單鏈DNA模板有哪些技巧？
對于點突變，建議使用非對稱單鏈DNA設計。對于大片段基因插入，有報道顯示插入基因側翼長度可從300到1000bp。在大多數情況下，500bp長度的同源臂就可以了。需要注意的是設計需要包含沉默突變的ssDNA模板，使sgRNA PAM序列發生突變，以避免二次切割。KI供體設計可能很復雜。強烈建議使用軟件（例如 snapgene）來查看和編輯序列。您可以閱讀以下文章以獲取更多設計技巧。
Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology.
Q16. 提高CRISPR KI 效率的小技巧
- sgRNA切割位點應靠近突變位點，一般情況，15bp 之內編輯效果較好。
- 在轉染gRNA/Cas9和供體模板之前優化轉染效率。
- 使用FACS篩選轉染的細胞。
- 如果允許的話，使用藥物或標記來選擇 KI 克隆（例如，在插入基因的 C 端標記嘌呤霉素抗性基因以進行選擇）。
