FAQ: CRISPR實驗遞送體系的選擇
Q1. CRISPR/Cas9 如何修飾真核基因組？
針對目標(biāo)序列設(shè)計的gRNA與Cas9結(jié)合，并將Cas9引導(dǎo)到目標(biāo)序列，目標(biāo)序列的PAM 序列上游 3-4 個堿基處，Cas9切割產(chǎn)生雙鏈斷裂(DSB)。
兩種方法可以修復(fù)雙鏈斷裂：1. 如果不提供修復(fù)模板或供體DNA，則會通過易出錯的非同源末端連接 (NHEJ) 進行重新鏈接，產(chǎn)生插入缺失從而敲除蛋白質(zhì)。2. 如果提供修復(fù)模板或供體DNA，則會通過同源重組(HDR)方式修復(fù)雙鏈斷裂，以準(zhǔn)確敲入目標(biāo)基因。
Q2. CRISPR實驗如何選遞送體系？
易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系可以選擇質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染效率低的細(xì)胞系建議選擇病毒，期望達(dá)到編輯效率更高、毒性更低的效果可以選擇RNP（即sgRNA+Cas9蛋白）的遞送系統(tǒng)。
Q3. 質(zhì)粒遞送體系中，all-in-one載體和雙載體如何選擇？
All-in-one載體系統(tǒng)有兩個主要優(yōu)點：
- 只需轉(zhuǎn)染一次宿主細(xì)胞
- 以 1:1 的比例進行g(shù)RNA和Cas9的導(dǎo)入
雙載體中，Cas9和gRNA 在不同的載體上獨立表達(dá)。如果您計劃表達(dá)多個gRNA以進行多重靶向，雙載體會更合適。對于這些應(yīng)用，Cas9應(yīng)首先在細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)，然后可以用不同的gRNA載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞以構(gòu)建細(xì)胞庫。
Q4. 什么時候需要慢病毒或腺相關(guān)病毒 (AAV) 載體？
CRISPR 基因編輯的載體選擇應(yīng)考慮應(yīng)用和細(xì)胞類型。
- 在大多數(shù)易于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中，非病毒載體可以發(fā)揮很好的作用。
- 慢病毒轉(zhuǎn)染可以用在瞬時轉(zhuǎn)染效率低的細(xì)胞中，例如原代細(xì)胞培養(yǎng)物或難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。
- AAV 載體具有低免疫原性，是體內(nèi)基因傳遞的較佳選擇。由于 AAV 載體的載量限制通常小于其他載體 (<5 kb)，將SpCas9基因包裝到這些載體中可能具有挑戰(zhàn)性。金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9) 比SpCas9小，是 AAV 載體的首選Cas9。
Q5. 直接導(dǎo)入Cas9蛋白效果比用質(zhì)粒DNA編碼Cas9蛋白更好嗎？
直接使用Cas9蛋白或RNP的優(yōu)勢有：
- 提高編輯效率：RNP中Cas9蛋白與sgRNA復(fù)合物結(jié)合率更高、更穩(wěn)定；
- 降低脫靶效應(yīng)：質(zhì)粒表達(dá)和消除可能受非預(yù)期因素干擾，而RNP中Cas9蛋白與sgRNA是非持續(xù)表達(dá)，結(jié)合后轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，避免切割非靶序列；
- 無DNA干擾：質(zhì)粒本質(zhì)是DNA，DNA可能隨機插入宿主DNA的斷裂處；
- 無免疫原性：Cas9蛋白較之質(zhì)粒，不易引起宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)，避免細(xì)胞因子等干擾；
- 簡便快捷：RNP轉(zhuǎn)導(dǎo)后即可進行基因編輯，1天后可檢測到編輯效率，自動降解。
