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檢測原理

• 原理示意圖
  

  圖1：檢測原理

• 檢測流程圖
  

  圖2：檢測流程圖

驗證數據

• 去干擾能力

  Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Pro對游離p24的去干擾能力

  

  圖3：有效減少游離p24的干擾
  將不同濃度的p24蛋白添加稀釋液中，結果顯示，Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Pro (GenScript, L00974) 基本不會檢測到添加到稀釋液中的游離p24蛋白。

  

  圖4：特異性檢測慢病毒顆粒上的p24蛋白
  將不同濃度的p24蛋白添加到純化的慢病毒樣本中，結果顯示，Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Pro (GenScript, L00974)，檢測到的p24蛋白濃度與實際慢病毒顆粒上p24濃度一致。

• 高準確度和回收率

  回收率用于確定分析物檢測是否受樣品基質差異的影響，通過將已知量的分析物加標到不同的樣品基質中來驗證回收率。以下是根據具有代表性的準確度驗證生成的報告和數據示例，在這項驗證中，使用3批次試劑盒（GenScript, L00938），將已知量的分析物加標到基質中混合驗證回收率，樣本重復測量3次。

  Table 1: 三批次試劑盒回收率測試結果為 86%-108%

  批次編號	重復次數	平均測值（pg/mL）	回收率
  #1	3	1945.30	86%
  #2	3	1787.64	108%
  #3	3	1752.76	90%

• 高檢測精密度

  A. 批內精密度/重復性

  批內精密度驗證體現測定板內每孔之間的重復性，有助于確保在測定板的不同孔中運行樣本檢測可以給出可靠的結果。
  以下是根據具有代表性的批內精密度驗證生成的報告和數據示例，在這項驗證中，使用金斯瑞p24檢測試劑盒（GenScript, L00938），分別對低、中、高3個濃度水平的樣本進行測試，每個樣本各重復檢測10次，每個樣本計算10次測量濃度結果的變異系數(CV)。

  Table 2: 三批次試劑盒批內精密度驗證結果

  批次編號	重復次數	平均測值（pg/mL）	%CV
  #1	10	215.55	3%
  #1	10	829.45	4%
  #1	10	1537.42	4%
  #2	10	209.60	5%
  #2	10	792.76	2%
  #2	10	1431.42	3%
  #3	10	188.09	6%
  #3	10	759.99	4%
  #3	10	1377.71	3%

  B. 批間精密度

  批間精密度體現同一樣品在多批測定間的重現性，有助于確保在不同批次試劑盒中運行樣本檢測可以給出可靠的結果。
  以下是根據具有代表性的批間精密度驗證生成的報告和數據示例，在這項驗證中，使用3個不同批次試劑盒（GenScript, L00938），分別對低、中、高3個濃度水平的樣本進行測試，每個樣本各重復檢測10次，每個樣本計算30次測量濃度結果的變異系數(CV)。

  Table 3: 三批次試劑盒批間差驗證結果

  批次數量	重復次數	平均測值 pg/mL	%CV
  3	3×10	204.41	7%
  3	3×10	794.07	5%
  3	3×10	1448.85	6%

• 慢病毒純化生產全流程滴度檢測

  使用慢病毒滴度p24試劑盒對慢病毒純化生產全流程進行慢病毒滴度監測，有利于慢病毒純化和成產過程控制和優化。金斯瑞慢病毒滴度p24試劑盒（GenScript, L00938）的超寬線性可以有效減小稀釋倍數，從而節約檢測時間以及減少稀釋過程導致的偏差。

  Table 4a: 金斯瑞慢病毒滴度p24試劑盒在慢病毒純化生產全流程的滴度檢測

  樣品名稱	樣品OD值	樣品檢測值 (pg/mL)	稀釋倍數	p24濃度 (LP/mL)	CV %
  HM上清液	3.151	2445.918	100	超出檢測范圍，無效	/
  	1.225	444.343	3000	1.67E+10
  PB核酸酶孵育	3.12	2369.055	100	超出檢測范圍，無效	/
  	1.242	451.997	3000	1.69E+10
  Centrifugation離心	3.103	2328.92	100	超出檢測范圍，無效	/
  	0.94	321.172	3000	1.20E+10
  CF-01澄清過濾	3.136	2405.64	100	超出檢測范圍，無效	/
  	0.926	315.765	3000	1.18E+10
  UF/DF濃縮換液	2.183	1040.264	3000	3.90E+10	3
  	0.152	36.234	90000	4.08E+10
  CF-02澄清過濾	1.994	890.168	3000	3.34E+10	6
  	0.142	32.441	90000	3.65E+10
  GF凝膠過濾	1.496	578.496	3000	2.17E+10	/
  	0.106	18.902	90000	超出檢測范圍，無效
  UF/DF-02濃縮換液	2.623	1501.37	3000	5.63E+10	3
  	0.185	47.906	90000	5.39E+10
  最終樣	3.155	2459.286	3000	超出檢測范圍，無效	/
  	0.799	265.916	90000	2.99E+11

  Table 4b: 競品慢病毒滴度p24試劑盒在慢病毒純化生產全流程的滴度檢測

  樣品名稱	樣品OD值	樣品檢測值 (pg/mL)	稀釋倍數	p24濃度 (LP/mL)	CV %
  HM上清液	1.223	86.687	12000	1.30E+10	/
  	3.143	291.899	2000	超出檢測范圍，無效
  PB核酸酶孵育	1.375	100.254	12000	1.50E+10	/
  	3.073	282.872	2000	超出檢測范圍，無效
  Centrifugation離心	1.073	73.79	12000	1.11E+10	/
  	3.019	275.974	2000	超出檢測范圍，無效
  CF-01澄清過濾	1.028	69.953	12000	1.05E+10	/
  	3.051	279.996	2000	超出檢測范圍，無效
  UF/DF濃縮換液	2.675	234.108	10000	超出檢測范圍，無效	/
  	0.653	39.453	60000	2.96E+10
  CF-02澄清過濾	2.484	212.127	10000	超出檢測范圍，無效	/
  	0.612	36.317	60000	2.72E+10
  GF凝膠過濾	2.048	165.17	10000	2.06E+10	5
  	0.522	29.342	60000	2.20E+10
  UF/DF-02濃縮換液	3.011	275.001	10000	超出檢測范圍，無效	/
  	1.021	69.346	60000	5.20E+10
  最終樣	0.64	38.46	480000	2.31E+11	/
  	2.765	244.786	80000	超出檢測范圍，無效

  * 紅色標記數據為超出檢測范圍數據

  在慢病毒純化生產的工藝開發過程中，9個工藝過程的18個樣品被采集并進行滴度檢測。實驗結果發現：
  1. 金斯瑞慢病毒滴度p24檢測試劑盒的稀釋倍數低于用競品的p24檢測試劑盒的稀釋倍數。
  2. 在稀釋慢病毒到慢病毒滴度p24檢測試劑盒的線性范圍的過程中，18個樣品使用金斯瑞慢病毒滴度p24檢測試劑盒一次稀釋成功率為 67%，而使用競品p24檢測試劑盒一次稀釋成功率為 56%。

常見問題解答

• 1. 物理滴度和感染滴度有什么區別？

  病毒滴度有兩種表示方式：以轉導測量的功能（傳染性）滴度或以病毒顆粒測量的物理滴度。物理滴度是測量樣本中存在多少病毒，通常根據蛋白質（例如p24）的水平計算。功能滴度是衡量有多少病毒可以感染細胞的指標，通常比物理滴度低 100-1000 倍。

• 2. 測試中樣本稀釋液如何選擇？

  對于Lentivirus Titer p24 ELISA Kit (GenScript, L00938)，可以使用試劑盒中稀釋后的1× Wash Solution進行樣本稀釋，效果是相同的。
  對于Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Pro (GenScript, L00974)，在分離游離p24階段，可以不對慢病毒上清樣本進行稀釋；若稀釋，則使用Cell culture medium（10% FBS）；在后續的ELISA檢測階段，可以使用試劑盒中稀釋后的1× Wash Solution稀釋。
  如果使用樣本或制劑buffer作為標準品和樣品的稀釋液，需要通過預實驗測試回收率是否符合預期，符合預期則可以使用，否則不建議使用。其他稀釋液例如超純水，未添加FBS的DMEM等都不能保證正常輸出結果。如果您需要驗證方面的支持，可以聯系我們。
  對于Lentivirus Titer p24 Kit Easy (GenScript, L01019)，推薦使用 Assay Dilution Buffer（GenScript, B00062）。自行配制推薦配方為 1×PBS，10% FBS，1‰ Tween 20。

• 3. Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Pro，Lentivirus Titer p24 ELISA Kit，Lentivirus Titer p24 Kit Easy 有什么區別？

  Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Pro 僅會檢測出慢病毒衣殼中的p24蛋白，不會檢測出游離的p24蛋白，通過ELISA方法測定，全程耗時約3 h。
  Lentivirus Titer p24 ELISA Kit 檢測的是總p24蛋白，包括游離的p24蛋白和慢病毒衣殼中的p24蛋白，通過ELISA方法測定，全程耗時約2.5 h。
  Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Easy 檢測的是總p24蛋白，通過化學放光法進行測定，孵育時間為15分鐘，檢測過程無需洗滌，全程耗時約30分鐘。

• 4. 金斯瑞的慢病毒滴度p24試劑盒是否含有人源樣本？

  均不含有人源材料，生物風險低。

• 5. 一個試劑盒可以檢測多少個樣本？

  Lentivirus Titer p24 ELISA Kit (GenScript, L00938)，Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Pro (GenScript, L00974) 試劑盒中各配有一塊預包被的96孔酶標板，其中包含8 孔 x 12 板條，我們建議按照說明書中推薦的標準曲線稀釋梯度，配置8個標準品工作液。 為了確保滴度的可靠定量，建議標準品和樣品均一式兩份進行重復測試。由此可計算出一個試劑盒可以測試40個樣本。
  Lentivirus Titer p24 Kit Easy (GenScript, L01019) 所提供的試劑可按照說明書建議的工作體積進行96次測定。如果使用384孔板進行測定，所用試劑體積可進行等比例減少，但需要進行預實驗確定測定的可靠性。

• 6. Lentivirus Titer p24 Kit Easy (GenScript, L01019) 需要額外購買組份嗎？

  本試劑盒中不提供檢測微孔板以及分析稀釋液，客戶可自行選購微孔板以及配制稀釋液。
  金斯瑞提供對應的產品：96-well Low Binding White Microplates & Sealers（GenScript, D00042）以及Assay Dilution Buffer（GenScript, B00062）。

• 7. Lentivirus Titer p24 Kit Easy (GenScript, L01019) 推薦使用何種檢測板？不同檢測板之間有什么區別？

  本品不固定檢測板型號，客戶可自行選擇合適的檢測板，以下為選擇指南：
  

  • 建議優先使用不透光的白色多孔檢測板檢測發光信號。例如96-well Low Binding White Microplates & Sealers（GenScript, D00042）；
  • 不透光的黑色多孔檢測板亦可用于本測試，信號相比于白色多孔檢測板低，低約一個數量級，但不影響樣品濃度的回算；
  • 底部透明但側壁不透光的微孔板，若搭配本產品進行測試，需要在進行檢測前，在微孔板底部貼一張白紙或白色封板膜以降低孔與孔之間光信號的交叉干擾；
  • 不推薦使用全透明微孔板，透明的側壁會使相鄰孔之間造成信號干擾，影響輸出準確值。

• 8. 測值超出線性范圍是否有效？

  無效。需要調整稀釋倍數重新復測。

• 9. 測試是否會出現邊緣效應？

  慢病毒滴度p24檢測試劑盒均為25℃反應，不會出現邊緣效應。

• 10. 使用洗板機進行測定時需要更多的洗液，是否可以提供額外的洗液試劑？

  可單獨選購 20× Wash Solution (GenScript, B00063)，該洗液適用于 Lentivirus Titer p24 ELISA Kit (GenScript, L00938)，Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Pro (GenScript, L00974) 。

• 11. 測定的讀值步驟需要使用什么樣的儀器？

  Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Pro, Lentivirus Titer p24 ELISA Kit 需使用能測定 450 nm 吸光度的酶標儀。酶標儀通過檢測酶標板中液體的吸光值，讀取OD值后進行定性或定量分析。
  Lentivirus Titer p24 ELISA Kit Easy 需使用能進行化學發光檢測的微孔板讀數儀/讀板機/酶標儀/分析儀。化學發光分析儀通過光電倍增管將化學發光反應（酶促發光或直接發光）產生的光信號轉換為相應的信號值，用RLU（相對光單位）表示，以達到定量或定性的檢測目的。

參考文獻

• Sena-Esteves M, Gao G. Titration of lentivirus vectors. CSH Protocols, 2018: 281-285.
• 國家藥品監督管理局，體外基因修飾系統藥學研究與評價技術指導原則（試行）.2022.

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