全基因組范圍基因敲除gRNA文庫(kù)（GeCKO v2.0）
金斯瑞提供專利引進(jìn)于Broad研究所張峰實(shí)驗(yàn)室的，能實(shí)現(xiàn)Human和Mouse細(xì)胞基因組范圍CRISPR敲除的gRNA文庫(kù)（GeCKO ），能夠在Human或Mouse細(xì)胞中快速產(chǎn)生功能缺失的突變體并且篩選所期望的表型。運(yùn)用GeCKO文庫(kù)可以在人或小鼠的基因組內(nèi)敲除任何表達(dá)基因及miRNA等非表達(dá)的基因。GeCKO文庫(kù)允許客戶在不同的條件下鑒定任何細(xì)胞功能必須的基因，篩選何種基因的缺失會(huì)使癌細(xì)胞具有耐藥性。GeCKO文庫(kù)已經(jīng)被廣泛使用于原代的人或小鼠細(xì)胞，干細(xì)胞，癌細(xì)胞及各種穩(wěn)定細(xì)胞系。GeCKO v2.0作為升級(jí)版的GeCKO文庫(kù)，加入非靶向gRNA作為對(duì)照，同時(shí)用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的慢病毒載體也同步進(jìn)行了升級(jí)，以便更高效的富集病毒和提升病毒在原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。
GeCKO v2.0文庫(kù)針對(duì)每個(gè)基因設(shè)計(jì)了6條gRNA序列，但為了降低后續(xù)轉(zhuǎn)染和篩選工作量的壓力將GeCKO v2.0文庫(kù)分成兩個(gè)文庫(kù)，文庫(kù)A和文庫(kù)B。每個(gè)文庫(kù)包含針對(duì)每個(gè)基因的3個(gè)gRNA，以及1,000個(gè)非靶向的對(duì)照性gRNA。A文庫(kù)還包含針對(duì)miRNA的gRNA（每個(gè)miRNA有4個(gè)gRNA）。為了確保針對(duì)每個(gè)基因的gRNA的完整表達(dá)，可以同時(shí)購(gòu)買A文庫(kù)和B文庫(kù)混合后使用；但如果細(xì)胞樣品和后續(xù)高通量篩能力有限，建議可以僅使用文庫(kù)A進(jìn)行篩選。
更多GeCKO文庫(kù)設(shè)計(jì)、構(gòu)建信息，請(qǐng)參考張峰實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的文獻(xiàn)：Sanjana N.E.，Shalem O.，Zhang F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods. 2014 Aug；11(8)：783-4. doi：10.1038/nmeth.3047.
文庫(kù)信息
| 文庫(kù) |
序列信息 |
| Human Library A |
65,383 sequences：
-
靶向19,050個(gè)基因，每3條gRNA靶向1個(gè)基因；
-
1,864個(gè)miRNA，每4條gRNA靶向1個(gè)miRNA；
-
1000條對(duì)照（非靶向性）gRNA。
|
| Human Library B |
58,028 sequences：
-
靶向19,050個(gè)基因，每3條gRNA靶向1個(gè)基因；
-
1000條對(duì)照（非靶向性）gRNA。
|
| Mouse Library A |
67,405 sequences：
-
靶向20,611個(gè)基因，每3條gRNA靶向1個(gè)基因；
-
1,175個(gè)miRNA，每4條gRNA靶向1個(gè)miRNA；
-
1000條對(duì)照（非靶向性）gRNA。
|
| Mouse Library B |
62,804 sequences：
-
靶向20,611個(gè)基因，每3條gRNA靶向1個(gè)基因；
-
1000條對(duì)照（非靶向性）gRNA。
|
金斯瑞GeCKO v2.0文庫(kù)交付形式和使用方法
GeCKO v2.0文庫(kù)中每一個(gè)gRNA都被克隆進(jìn)優(yōu)化的慢病毒載體，與輔助細(xì)胞共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后可形成高滴度的病毒，最終gRNA序列可在目的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)錄。
完成病毒包裝的GeCKO v2.0文庫(kù)應(yīng)與目的細(xì)胞進(jìn)行較低的MOI進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以確保進(jìn)入單個(gè)細(xì)胞的gRNA數(shù)量不超過(guò)1個(gè)。在完成轉(zhuǎn)染后，開(kāi)始篩選工作之前，應(yīng)進(jìn)行一輪NGS深度測(cè)序，評(píng)估細(xì)胞池中g(shù)RNA的表達(dá)情況。在篩選結(jié)束后再進(jìn)行第二輪NGS深度測(cè)序，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 確定篩選過(guò)程中丟失或富集的gRNA序列。
GeCKO文庫(kù)交付規(guī)格
-
文庫(kù)（轉(zhuǎn)染級(jí)）以25μg為一個(gè)單位量。100μg及200μg文庫(kù)分別是以4x25μg或者8x25μg形式交付。
-
提供項(xiàng)目報(bào)告及二代測(cè)序驗(yàn)證的統(tǒng)計(jì)摘要及COA文件，如您需要，還可提供完整可用的NGS原始數(shù)據(jù)。
