FAQ: CRISPR實驗關鍵試劑的選擇
Q6. 化學合成的sgRNA與利用體外轉錄（IVT）sgRNA有什么區別？
化學合成sgRNA主要有以下優勢：
- 編輯效率高：金斯瑞研發和Nat. Biotechnol等文獻均發現化學合成sgRNA的編輯效率高于體外轉錄sgRNA；
- 細胞毒性低：體外轉錄sgRNA帶有5'三磷酸修飾，會引起細胞免疫反應，造成細胞毒性，干擾后續實驗，而化學合成的sgRNA則不存在該干擾因素；
- 更穩定：化學合成sgRNA可添加硫代和甲氧基修飾，使其在儲存和試驗中更穩定，且化學合成工藝的穩定性和一致性優于生物合成，可以保證下游實驗的可重復性；
- 操作簡單：化學合成sgRNA即買即用，體外轉錄sgRNA需要2-3 天、5-6步合成操作，經濟和時間成本高。
Q7. 使用合成sgRNA與使用crRNA:tracrRNA雙鏈體有什么不同？
使用 sgRNA 時，無需在使用前對crRNA和tracrRNA雙鏈體進行退火。更重要的是，幾項研究表明，當與 Cas9 共同作用時，長單鏈sgRNA 比 crRNA：tracrRNA 具有更好的穩定性，從而有更高的編輯效率1, 2。
- Hendel, et al., Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat. Biotechnol., 33 (2015) 985-989.
- Ryan et al., Improving CRISPR–Cas specificity with chemical modifications in single-guide RNAs. Nucleic Acids Research, 46 (2018) 2: 792–803.
Q8. gRNA序列應該如何設計？
設計您的 gRNA 序列包括 4 個步驟：
- 確定目標基因位點。
- 尋找適合gRNA靶向的序列。
- 檢查脫靶結合的可能性。
- 選擇位于結合區域內的gRNA序列。
通過提供脫靶評分和染色體位置，金斯瑞的gRNA數據庫和在線設計工具將消除您在選擇gRNA序列時的疑慮，建議使用3個gRNA序列，以確保敲除和實驗準確性。
Q9. 進行CRISPR介導的基因KI時，如何從各種HDR模板中進行選擇？我應該選擇雙鏈DNA、質粒DNA還是單鏈DNA？
這取決于實驗目的和宿主細胞類型。與雙鏈DNA供體相比，單鏈DNA表現出顯著提高編輯效率和特異性，以及減少脫靶整合的優勢，尤其是在編輯原代細胞、干細胞和開發轉基因動物模型方面。
| 質粒DNA | dsDNA | ssDNA | |
|---|---|---|---|
| 敲入效率 | 中等 | 高 | 高 |
| 脫靶效應 | 中等 | 高 | 低 |
| 細胞毒性 | 高 | 高 | 低 |
| 成本 | 低 | 中等 | 較高 |
Q5. 金斯瑞為單鏈DNA模板提供哪些質量控制檢測？
- Sanger測序，以確保單鏈DNA序列的準確性；
- 通過凝膠電泳對最終單鏈DNA產品進行純度測試。
在單鏈DNA的生產過程中，我們進行了兩輪測序，以保證序列的準確性。我們首先通過測序選擇經過序列驗證的質粒DNA模板，以確保最終單鏈DNA產品的純度和序列準確性。此外，我們對最終的單鏈DNA產品使用直接測序來確認單鏈DNA產品的序列正確性。最終的單鏈DNA產品僅包含全長、經過序列驗證的單鏈DNA分子。通過使用我們專有的、正在申請專利的酶合成方法，金斯瑞提供的單鏈DNA產品不含雙鏈DNA。
