CRISPR實(shí)驗(yàn)遞送體系的選擇

• Q1. CRISPR/Cas9如何修飾真核基因組？

  針對(duì)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)的gRNA與Cas9結(jié)合，并將Cas9引導(dǎo)到目標(biāo)序列，目標(biāo)序列的PAM序列上游3-4個(gè)堿基處，Cas9切割產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB）。

  兩種方法可以修復(fù)雙鏈斷裂：1. 如果不提供修復(fù)模板或供體DNA，則會(huì)通過易出錯(cuò)的非同源末端連接 (NHEJ) 進(jìn)行重新鏈接，產(chǎn)生插入缺失從而敲除蛋白質(zhì)。2. 如果提供修復(fù)模板或供體DNA，則會(huì)通過同源重組(HDR)方式修復(fù)雙鏈斷裂，以準(zhǔn)確敲入目標(biāo)基因。

  
• Q2. CRISPR實(shí)驗(yàn)如何選遞送體系？

  易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系可以選擇質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染效率低的細(xì)胞系建議選擇病毒，期望達(dá)到編輯效率更高、毒性更低的效果可以選擇RNP（即sgRNA+Cas9蛋白）的遞送系統(tǒng)。

• Q3. 質(zhì)粒遞送體系中，all-in-one載體和雙載體如何選擇？

  All-in-one載體系統(tǒng)有兩個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)：

  • 只需轉(zhuǎn)染一次宿主細(xì)胞
  • 以1:1的比例進(jìn)行g(shù)RNA和Cas9的導(dǎo)入

  雙載體中，Cas9和gRNA在不同的載體上獨(dú)立表達(dá)。如果您計(jì)劃表達(dá)多個(gè)gRNA以進(jìn)行多重靶向，雙載體會(huì)更合適。對(duì)于這些應(yīng)用，Cas9應(yīng)首先在細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)，然后可以用不同的gRNA載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞以構(gòu)建細(xì)胞庫(kù)。

• Q4. 什么時(shí)候需要慢病毒或腺相關(guān)病毒（AAV）載體？

  CRISPR 基因編輯的載體選擇應(yīng)考慮應(yīng)用和細(xì)胞類型。

  • 在大多數(shù)易于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中，非病毒載體可以發(fā)揮很好的作用。
  • 慢病毒轉(zhuǎn)染可以用在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率低的細(xì)胞中，例如原代細(xì)胞培養(yǎng)物或難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。
  • AAV載體具有低免疫原性，是體內(nèi)基因傳遞的較佳選擇。由于AAV載體的載量限制通常小于其他載體（<5 kb），將SpCas9基因包裝到這些載體中可能具有挑戰(zhàn)性。金黃色葡萄球菌Cas9（SaCas9）比SpCas9小，是AAV載體的首選Cas9。
• Q5. 直接導(dǎo)入Cas9蛋白效果比用質(zhì)粒DNA編碼Cas9蛋白更好嗎？

  直接使用Cas9蛋白或RNP的優(yōu)勢(shì)有：

  • 提高編輯效率：RNP中Cas9蛋白與sgRNA復(fù)合物結(jié)合率更高、更穩(wěn)定；
  • 降低脫靶效應(yīng)：質(zhì)粒表達(dá)和消除可能受非預(yù)期因素干擾，而RNP中Cas9蛋白與sgRNA是非持續(xù)表達(dá)，結(jié)合后轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，避免切割非靶序列；
  • 無DNA干擾：質(zhì)粒本質(zhì)是DNA，DNA可能隨機(jī)插入宿主DNA的斷裂處；
  • 無免疫原性：Cas9蛋白較之質(zhì)粒，不易引起宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)，避免細(xì)胞因子等干擾；
  • 簡(jiǎn)便快捷：RNP轉(zhuǎn)導(dǎo)后即可進(jìn)行基因編輯，1天后可檢測(cè)到編輯效率，自動(dòng)降解。

CRISPR實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵試劑的選擇

• Q6. 化學(xué)合成的sgRNA與利用體外轉(zhuǎn)錄（IVT）sgRNA有什么區(qū)別？

  化學(xué)合成sgRNA主要有以下優(yōu)勢(shì)：

  • 編輯效率高：金斯瑞研發(fā)和Nat. Biotechnol等文獻(xiàn)均發(fā)現(xiàn)化學(xué)合成sgRNA的編輯效率高于體外轉(zhuǎn)錄sgRNA；
  • 細(xì)胞毒性低：體外轉(zhuǎn)錄sgRNA帶有5'三磷酸修飾，會(huì)引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，造成細(xì)胞毒性，干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)，而化學(xué)合成的sgRNA則不存在該干擾因素；
  • 更穩(wěn)定：化學(xué)合成sgRNA可添加硫代和甲氧基修飾，使其在儲(chǔ)存和試驗(yàn)中更穩(wěn)定，且化學(xué)合成工藝的穩(wěn)定性和一致性優(yōu)于生物合成，可以保證下游實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性；
  • 操作簡(jiǎn)單：化學(xué)合成sgRNA即買即用，體外轉(zhuǎn)錄sgRNA需要2-3天、5-6步合成操作，經(jīng)濟(jì)和時(shí)間成本高。
• Q7. 使用合成sgRNA與使用crRNA:tracrRNA雙鏈體有什么不同？

  使用sgRNA時(shí)，無需在使用前對(duì)crRNA和tracrRNA雙鏈體進(jìn)行退火。更重要的是，幾項(xiàng)研究表明，當(dāng)與Cas9共同作用時(shí)，長(zhǎng)單鏈sgRNA比crRNA：tracrRNA具有更好的穩(wěn)定性，從而有更高的編輯效率^{1, 2}。

  1. Hendel, et al., Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat. Biotechnol., 33 (2015) 985-989.
  2. Ryan et al., Improving CRISPR–Cas specificity with chemical modifications in single-guide RNAs. Nucleic Acids Research, 46 (2018) 2: 792–803.
• Q8. gRNA序列應(yīng)該如何設(shè)計(jì)？

  設(shè)計(jì)您的gRNA序列包括4個(gè)步驟：

  1. 確定目標(biāo)基因位點(diǎn)。
  2. 尋找適合gRNA靶向的序列。
  3. 檢查脫靶結(jié)合的可能性。
  4. 選擇位于結(jié)合區(qū)域內(nèi)的gRNA序列。

  通過提供脫靶評(píng)分和染色體位置，金斯瑞的gRNA數(shù)據(jù)庫(kù)和在線設(shè)計(jì)工具將消除您在選擇gRNA序列時(shí)的疑慮，建議使用3個(gè)gRNA序列，以確保敲除和實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。

• Q9. 進(jìn)行CRISPR介導(dǎo)的基因KI時(shí)，如何從各種HDR模板中進(jìn)行選擇？我應(yīng)該選擇雙鏈DNA、質(zhì)粒DNA還是單鏈DNA？

  這取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮退拗骷?xì)胞類型。與雙鏈DNA供體相比，單鏈DNA表現(xiàn)出顯著提高編輯效率和特異性，以及減少脫靶整合的優(yōu)勢(shì)，尤其是在編輯原代細(xì)胞、干細(xì)胞和開發(fā)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型方面。

  	質(zhì)粒DNA	dsDNA	ssDNA
  敲入效率	中等	高	高
  脫靶效應(yīng)	中等	高	低
  細(xì)胞毒性	高	高	低
  成本	低	中等	較高

• Q5. 金斯瑞為單鏈DNA模板提供哪些質(zhì)量控制檢測(cè)？
  1. Sanger測(cè)序，以確保單鏈DNA序列的準(zhǔn)確性；
  2. 通過凝膠電泳對(duì)最終單鏈DNA產(chǎn)品進(jìn)行純度測(cè)試。

  在單鏈DNA的生產(chǎn)過程中，我們進(jìn)行了兩輪測(cè)序，以保證序列的準(zhǔn)確性。我們首先通過測(cè)序選擇經(jīng)過序列驗(yàn)證的質(zhì)粒DNA模板，以確保最終單鏈DNA產(chǎn)品的純度和序列準(zhǔn)確性。此外，我們對(duì)最終的單鏈DNA產(chǎn)品使用直接測(cè)序來確認(rèn)單鏈DNA產(chǎn)品的序列正確性。最終的單鏈DNA產(chǎn)品僅包含全長(zhǎng)、經(jīng)過序列驗(yàn)證的單鏈DNA分子。通過使用我們專有的、正在申請(qǐng)專利的酶合成方法，金斯瑞提供的單鏈DNA產(chǎn)品不含雙鏈DNA。

脫靶效應(yīng)的檢測(cè)與規(guī)避方案

• Q11. 影響CRISPR靶向性效率和特異性的因素有哪些？

  影響CRISPR靶向效率和特異性的因素有：

  • gRNA設(shè)計(jì)：金斯瑞開發(fā)的gRNA設(shè)計(jì)軟件基于NCBI權(quán)威文獻(xiàn)開發(fā)和驗(yàn)證的算法，選擇合適目標(biāo)序列以避免脫靶效應(yīng)，該算法在目標(biāo)基因中尋找一個(gè)約20bp的序列，在其他位置沒有出現(xiàn)與其高度相似的序列。因?yàn)間RNA和非目標(biāo)的內(nèi)源基因組之間的錯(cuò)配數(shù)小于3個(gè)時(shí)，可能發(fā)生Cas9介導(dǎo)的脫靶效應(yīng)。
  • 核酸酶/靶向策略：大多數(shù)研究使用從化膿性鏈球菌中分離的Cas9核酸酶。Cas9 WT誘導(dǎo)雙鏈斷裂，通常通過非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)，這會(huì)引入導(dǎo)致移碼和蛋白質(zhì)表達(dá)完全喪失的小段基因嵌入或缺失，這已被證明是在每個(gè)細(xì)胞系和生物體中引入表型敲除的一種簡(jiǎn)單有效的方法。另一種策略是使用這種酶的突變體Cas9-D10A（切口酶），它可用于在目的區(qū)域兩側(cè)誘導(dǎo)兩條單鏈斷裂，以進(jìn)行更特異的敲除。如果您需要用于不同酶的gRNA序列，或者您對(duì)CRISPR靶向策略有其他特殊要求，請(qǐng)發(fā)送郵件至[email protected]咨詢。
  • gRNA序列的數(shù)量：通常單個(gè)gRNA足以敲除目標(biāo)基因；但是，我們建議您為每個(gè)目標(biāo)基因訂購(gòu)三個(gè)序列的gRNA，以提高基因組編輯的成功率，避免出現(xiàn)脫靶效應(yīng)。

  在金斯瑞訂購(gòu) gRNA質(zhì)粒，我們會(huì)提供一個(gè)經(jīng)過序列驗(yàn)證的質(zhì)粒，其中包含gRNA表達(dá)和基因組結(jié)合所需的所有元素：U6啟動(dòng)子、間隔（目標(biāo)）序列、gRNA骨架和終止子。我們保證提供的gRNA克隆序列準(zhǔn)確；然而，鑒于構(gòu)建基因組編輯細(xì)胞系以及轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性，我們無法保證使用我們的gRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。如果您希望使用CRISPR技術(shù)創(chuàng)建經(jīng)過序列驗(yàn)證的KO或KI細(xì)胞系，請(qǐng)參閱GenCRISPR?基因編輯細(xì)胞系服務(wù)。

• Q12. 如何降低脫靶效應(yīng)？

  降低脫靶效應(yīng)的方法：

  1. 選擇特異的gRNA；
  2. 使用RNP；
  3. 使用eSpCas9；
  4. 使用Nickase Cas9；
• Q13. 如何檢測(cè)是否發(fā)生脫靶？

  基因編輯的脫靶率檢測(cè)一般有兩種方法：

  1. 選擇潛在的脫靶位點(diǎn)，例如選擇gRNA預(yù)測(cè)網(wǎng)站上Top 5潛在脫靶位點(diǎn)，進(jìn)行Sanger測(cè)序單克隆；
  2. 預(yù)算允許的情況下，通過全基因組測(cè)序的方法進(jìn)行全基因組序列的分析和比對(duì)更精準(zhǔn)，例如基于NGS的iGUIDE方法。

CRISPR實(shí)驗(yàn)的技巧

• Q14. 轉(zhuǎn)染或?qū)胄实驮趺磧?yōu)化？

  一般來說主要通過以下方法：

  • 測(cè)試不同的轉(zhuǎn)染試劑，如不同廠家的Lipo產(chǎn)品；
  • 測(cè)試不同的電轉(zhuǎn)條件，如不同的電壓或者電轉(zhuǎn)buffer；
  • 測(cè)試不同的病毒感染條件，比如不同MOI，不同的Polybrene濃度。
• Q15. 設(shè)計(jì)有效的單鏈DNA模板有哪些技巧？

  對(duì)于點(diǎn)突變，建議使用非對(duì)稱單鏈DNA設(shè)計(jì)。對(duì)于大片段基因插入，有報(bào)道顯示插入基因側(cè)翼長(zhǎng)度可從300到1000bp。在大多數(shù)情況下，500bp長(zhǎng)度的同源臂就可以了。需要注意的是設(shè)計(jì)需要包含沉默突變的ssDNA模板，使sgRNA PAM序列發(fā)生突變，以避免二次切割。KI供體設(shè)計(jì)可能很復(fù)雜。強(qiáng)烈建議使用軟件（例如 snapgene）來查看和編輯序列。您可以閱讀以下文章以獲取更多設(shè)計(jì)技巧。

  Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology.

• Q16. 提高CRISPR KI效率的小技巧
  1. sgRNA切割位點(diǎn)應(yīng)靠近突變位點(diǎn)，一般情況，15bp 之內(nèi)編輯效果較好。
  2. 在轉(zhuǎn)染gRNA/Cas9和供體模板之前優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率。
  3. 使用FACS篩選轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
  4. 如果允許的話，使用藥物或標(biāo)記來選擇 KI 克隆（例如，在插入基因的 C 端標(biāo)記嘌呤霉素抗性基因以進(jìn)行選擇）。

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