蛋白表達

• 客戶為什么要選擇金斯瑞生產定制蛋白表達？

  金斯瑞提供的與眾不同的蛋白質服務具有以下特點：

  （a）我們有經驗豐富的科學家來服務于您的定制要求 - 我們已經成功交付>10,000批次定制蛋白，>5,000批次定制抗體。（b）高成功率 - 我們的大腸桿菌表達系統成功率高達95％；其他表達系統的成功率也遠高于行業平均水平。（c）高容量 - 高達2,000L的細菌/酵母蛋白大規模發酵，高達100L的昆蟲以及200L哺乳動物蛋白大規模發酵。（d）金斯瑞具有成熟且先進的技術平臺。

• 金斯瑞在定制蛋白服務方面經驗如何？

  2003年，金斯瑞開始提供定制蛋白表達服務。金斯瑞擁有15+年的蛋白表達經驗，擁有在國外大型生物醫藥公司工作25年經驗的蛋白表達專家，建立了強大的技術團隊，可以幫您選擇更為優質的實驗方案，助力您的研發進程。截止2019年底，我們已為客戶成功生產并交付超過15,000批次定制蛋白。

• 金斯瑞提供哪些蛋白表達系統？

  金斯瑞能提供大腸桿菌表達系統，昆蟲細胞表達系統和哺乳動物表達系統的定制蛋白服務。

• 如何選擇合適的蛋白表達系統？各個表達系統的優缺點？

  這取決于客戶蛋白的來源（細菌、動物或其它）和純化蛋白的用途。如果不需要對蛋白進行翻譯后修飾，我們推薦低成本、高成功率的大腸桿菌表達系統；反之，我們將根據客戶的預算和具體的要求推薦昆蟲細胞，或哺乳動物細胞表達系統。請垂詢我們的專業客服代表，竭誠為客戶推薦合適的表達系統。

  系統	優點	缺點
  E.coli	成本低，表達高，周期短	無翻譯后修飾； 可能形成包涵體，純化后影響活性
  Insect	蛋白存在翻譯后修飾，糖基化類型與天然蛋白稍有不同。 適合表達激酶或病毒蛋白，大分子量蛋白。	成本稍高 周期較原核長
  Mammalian	蛋白翻譯后修飾非常接近天然蛋白。 非常適合重組抗體的表達(表達量高)	成本高

• 金斯瑞蛋白表達平臺的能力？

  細菌表達系統：（a）提供大量的高達克級的蛋白產品（b）提供10 - 2,000L范圍內的細菌發酵服務（c）提供純度超過98%的均質重組蛋白。 桿狀病毒昆蟲細胞表達系統：（a）提供攜帶目的基因（一個或者多個）的高滴度重組桿狀病毒儲液，滴度高達10^9pfu/ ml（b）提供純度超過98％的均質重組蛋白（c）提供多達數百毫克的蛋白產品（或100L培養液）。 哺乳動物細胞表達系統：（a）提供純度超過98％的均質重組蛋白（b）提供毫克至克級的蛋白產品（或200升培養液）。

• 密碼子優化真的重要么？基因部門與蛋白部門的密碼子優化有什么區別嗎？密碼子優化是否促進解決表達可溶性蛋白？

  密碼子優化能大幅度提高蛋白的表達水平，金斯瑞由于OptimumGene?密碼子優化技術。數千實例已證明金斯瑞密碼子優化的有效性。

  目前蛋白部與基因部密碼子優化使用的是同一套系統，密碼子優化僅能促進蛋白表達量提高，無法促進可溶。

• 對于不同的表達系統，從1L中試培養物中通常能得到多少蛋白？

  不同的表達系統蛋白表達水平不同，以下是3種表達系統的蛋白表達平均水平：
  a. 細菌表達系統平均1-5mg/L，高達3g/L；
  b. 昆蟲表達系統平均1-3mg/L，部分蛋白可以達到35mg/L以上；
  c. 哺乳動物表達系統平均1-40mg/L(常規重組蛋白)和50-100mg/L（抗體），根據不同抗體種屬和具體序列會有些許不同。高達3g/L。

• 為什么金斯瑞建議在放大前進行1L中試蛋白表達？

  通過優化1L中試規模下的蛋白表達條件，我們可以準確地評估您的定制蛋白的培養體系和純化條件，以便為您節省時間和預算。

• 蛋白的分子量（MW）對蛋白生產有影響嗎？

  金斯瑞的蛋白服務能表達分子量10-250KD的蛋白（大腸桿菌系統：150KD；其它系統：250KD）。生產更大分子量的蛋白會越來越困難，因為分子量過大的蛋白在表達時極易降解或者表達困難。

• 為什么金斯瑞需要詢問表達蛋白的天然形式是否為一種膜蛋白，細胞質蛋白，酶或蛋白酶或IgG抗體？

  與細胞內蛋白不同，大部分膜蛋白原核表達困難，真核表達較好，但純化涉及到多種表面活性劑篩選，往往純化較困難。對于酶或者蛋白酶，需要保持蛋白活性，所以純化一般在低溫下進行，并且會添加保護劑。

• 對于抗體制備，對抗原蛋白是否有特殊要求？

  抗原（蛋白）需要溶于PBS或者其他的不含有機溶劑的緩沖液中?？乖鞍滓话愀驇撕灒ㄈ?xHis，HA，FLAG，V5，c-myc）。對于單克隆抗體的制備，要求蛋白抗原含量應大于2mg，純度大于75％。用于診斷型或功能型單克隆抗體的開發的抗原，需要更高的純度，一般需要85％-90％的純度；對于多克隆抗體的制備，蛋白抗原含量應大于4mg，純度大于85％（如需獲得純化的多克隆抗體，則請另外提供5mg抗原蛋白）。濃度一般要求>0.4mg/ml。

• 大腸桿菌表達系統獲得蛋白的濃度通常能達到多少？如果客戶需要純化的蛋白純度達到xx mg/ml，是否可以做到？

  獲得蛋白的濃度通常在0.1 - 3 mg/ml之間（保證大于0.1mg/ml）。我們可以根據客戶的要求濃縮蛋白（大多數情況下不額外收取費用），如果濃縮過程中發現蛋白在高濃度下不穩定會及時與您溝通儲存在合適的濃度中，避免蛋白大量損失。

• 如果蛋白在大腸桿菌系統中不能成功表達或者純化怎么辦？成功率有多高？

  金斯瑞專家建議通過以下方法來解決這個問題：（1）如果沒有進行過密碼子優化，建議進行密碼子優化（2）去除跨膜區和信號肽區域（3）盡量表達蛋白的截短域（4）嘗試不同的標簽，以增加蛋白表達水平（5）嘗試不同的表達系統（比如昆蟲細胞表達系統可用于表達某些特定蛋白）。
  如果蛋白不表達或純化后未得到蛋白，我們將根據實驗步驟收取費用。對于所有的套餐，我們都會交付蛋白表達評估報告。我們目前已表達上萬個蛋白，原核表達成功率在95%以上。

• 金斯瑞能否對酵母和昆蟲系統表達的蛋白進行復性？

  大多數情況下，昆蟲表達系統表達的蛋白是可溶的，所以我們一般不對昆蟲系統表達的蛋白進行復性。特殊情況下，蛋白可溶較差，真核表達系統中蛋白也出現了不可溶的現象，如果您不介意蛋白復性，我們可以進一步嘗試復性蛋白。

• 如果客戶提供桿狀病毒，金斯瑞需要多少病毒來生產蛋白？

  如客戶提供桿狀病毒，還請提供以下信息：桿狀病毒滴度和病毒儲液代數，感染所需的MOI，細胞密度和細胞體積。我們將使用相關公式來計算需添加多少病毒儲液，以獲得所需要的接種量（ml）。MOI指每個細胞所含的病毒顆粒數目。 通常，P1和P2代病毒儲液是較佳選擇，病毒儲液滴度應大于10 ^ 7 pfu/ ml。 同時，如果您提供的病毒量不足，我們還提供病毒擴增的服務。

• 什么是"晶體學級"蛋白？

  用于結晶的蛋白質應該是均勻的并且純度大于90％。結晶前需通過HPLC或者MS檢測蛋白純度是否達標。 DLS（動態光散射）檢測結果對純度鑒定有所幫助，但不是必需的。結晶需要的蛋白最低量是10μg*300μl。

• 客戶想表達一個由兩個亞基構成的異源二聚體，金斯瑞有何建議，是構建一個重組載體還是分別構建兩個重組載體？

  具體的實驗策略應根據實際情況而定，對于某些蛋白兩種方案都可行。金斯瑞在這兩種情況下都有成功的紀錄。

• 客戶是用蛋白自身的信號肽，還是金斯瑞的人工信號肽？

  原核：一般去除信號肽表達，如需要分泌表達，建議用原核表達載體常用的pelB，MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA，比如PET22b載體；

  昆蟲細胞：替代目的基因信號肽：gp67信號肽：MLLVNQSHQG FNKEHTSKMV SAIVLYVLLA AAAHSAFA

  哺乳動物細胞：信號肽默認用GenScript default signal peptide。

• 克隆方案中His標簽放在N端還是C端好？

  如果您表達的蛋白大小適中，且后續不需要切除標簽，N端或者C端都可以；如果您表達的蛋白較小，建議放在C端，可以緩解蛋白降解；如果您后續需要酶切標簽，建議放在N端，可以避免氨基酸殘留。

• 蛋白表達可以承接的最小蛋白是多少個氨基酸？蛋白服務和長鏈多肽服務如何界定？目前金斯瑞是否可承接毒性蛋白生產業務？

  最小承接過的蛋白為70aa，<50aa一般做多肽合成，>50aa多肽合成困難可以嘗試表達。對于對人體有害的有毒蛋白表達不做承接，其他毒性蛋白根據情況分析后確定是否可以承接。

• 如果客戶有一個蛋白需要在哺乳動物表達系統中進行表達，但是這個蛋白是胞內蛋白，金斯瑞有什么建議？

  哺乳動物系統不接受胞內蛋白表達需求，可以嘗試用其他表達系統，比如ecoli和insect系統。

• 客戶提供質粒的話，需要同時提供質粒的哪些信息，提供的質粒需要做檢測嗎？

  質粒的載體，目的序列，插入位點。最好提供包含目的基因的全載體序列。如果您對質粒的信息非常清楚，可以不做檢測。如果并不很清楚，且表達出現問題，建議先安排測序。

• 金斯瑞在構建表達嵌合抗體時是否總是加入Kozak序列？為什么使用Kozak序列？

  是的，我們在所有嵌合結構中使用Kozak序列。Kozak共識序列（例如GCCACCatgG）在真核mRNA的翻譯過程中起到作用，對于提高蛋白表達也是必須的。

• 如果客戶提供可變區，需要金斯瑞提供恒定區，金斯瑞的建議是什么？用人和鼠的在表達量和活性上有什么不同嗎？在哺乳動物定制表達載體中已構建的11種恒定區有哪些？哪些是GenScript向客戶推薦的？為什么這些比其他好？

  金斯瑞可以提供通用的恒定區序列，做小鼠和人類嵌合載體。嵌合抗體在結合抗原方面的活性沒有變化，但因為Fc不同生物活性會有不同，人抗和鼠抗的表達水平不同，甚至同一種屬的不同亞類也會不同。我們在pcDNA3.4中構建了10種恒定區，10個恒定區是hIgG1, hIgG4, hIgkappa, hIglamda, mIgG1, mIgG2a, mIgG2b, Rabbit IgG, Rabbit Kappa和mIgkappa。我們通常分別使用hIgG1 / kappa和mIgG2a / kappa作為人和小鼠嵌合抗體，因為這部分恒定區的表達量較高。

• 如果客戶想要同時表達兩個基因，金斯瑞是否建議與兩個載體共轉染，或者更喜歡將兩個基因放在一個載體中？哪一種方法對成功交付更有信心？

  兩種方法都有優點和缺點（用兩種載體共轉染或在一種載體中插入兩種基因）。最好了解更多細節/或與客戶討論具體項目目的后，來確定哪種方法是更好的選擇。

• 金斯瑞最常用的轉染方法是什么？與其它方法（比如常規脂質體）相比，使用高分子聚合物PEI的優勢是什么？

  我們使用聚乙烯亞胺（PEI）作為瞬時表達的轉染試劑。因為與其他方法相比，它具有低成本、易于使用和相對高轉染效率的優勢。 Lipofectamine轉染效率通常很高。然而，其高成本限制了其用于小規模和大規模瞬時表達。

• 如果瞬時表達的表達水平較低，通常如何調整或優化實驗方案以提高表達水平？

  通常蛋白表達情況主要由蛋白由自身性質決定，常用的優化措施如下：密碼子優化、轉染方式優化（特別是對一些轉染效率低的細胞系）、優化細胞培養方案、測試細胞裂解液分析蛋白質是分泌表達情況、改變宿主細胞系：293-6E、CHO-3E7、HD 293F、HD CHO-s，改變信號肽、改變表達載體、克隆策略（比如Fc標簽策略，位點突變）、純化步驟的緩沖篩選（沉淀，溶解度）、加蛋白酶抑制劑（如果有蛋白降解現象）。

• 什么會影響基因合成和表達的成本？

  基因合成成本主要取決于基因的長度和復雜性。表達（蛋白質生產）成本主要受以下因素影響：1）您選擇的表達系統（大腸桿菌，昆蟲或哺乳動物），2）您需要的蛋白質量和純度，以及3）其他特殊要求（例如標簽去除，內毒素水平控制，特殊標簽等）。

• 客戶可以提供Bacmid做蛋白表達嗎？

  我司通常建議客戶可以提供pFast Bac plasmid，因為提供pFast Bac plasmid和Bacmid對生產時間和價格影響不大，且Bacmid不易保存。當然，如果客戶能確保Bacmid在運輸過程中無雜菌污染，我司也能接受。

• 是否接受客戶提供高質量的質粒直接進行哺乳動物細胞轉染表達？

  我司不建議使用客戶提供質粒轉染細胞進行蛋白表達，因為哺乳動物細胞比較敏感，如果質粒在運輸過程中被污染，可能會嚴重影響蛋白表達情況。而且，金斯瑞可以從基因合成開始（不需要客戶提供模板），提供高品質的質粒用于細胞轉染。

• 進行1L哺乳動物細胞瞬轉蛋白表達周期是?

  1L蛋白瞬轉表達（包括基因合成）短至6周，1L抗體瞬轉表達（包括基因合成）短至5周。

• 能否請公司先做評估，然后再決定是否要訂購瞬時表達或穩定的細胞系？

  在做瞬轉放大或進行穩定細胞系生成之前，我司會先進行小規模表達評價，并且需要客戶決定是否想要做瞬時表達或進行穩定細胞系構建。用于瞬時表達的載體與用于穩定細胞系的載體不同。

蛋白純化

• 在大腸桿菌蛋白表達系統中，你們是從細胞裂解液的可溶成分還是包涵體中純化蛋白？你們能否折疊復性包涵體蛋白？復性是否可以達到天然狀態？

  我們可從這兩種成分中純化蛋白，具體哪一種取決于客戶的要求，或可行的實驗方案，我們的專家在蛋白質折疊復性方面經驗豐富。我們有包涵體蛋白復性的專業服務，會根據蛋白質的序列及其結構特性選擇特定的復性策略。原核表達本身缺乏翻譯后修飾，復性可以盡量接近天然狀態，但無法保證。

• 蛋白表達過程中，雜質有些什么？如何去除這些雜質？金斯瑞內部有哪些蛋白純化方法？如何選擇使用哪種純化方法？多步純化常用純化流程？

  金斯瑞能提供親和純化，離子交換層析，疏水層析和分子篩層析。雜質大多是細胞內或培養基內的物質，可以通過層析技術去除。 一般對于含有親和標簽的蛋白，首選親和層析后根據得到的蛋白純度以及雜蛋白的位置性質，相應選擇多步純化的步驟。

• 金斯瑞平臺能否提供抗體親和純化？

  如果客戶提供實驗方案，我們便能提供相關服務。

• 客戶希望蛋白不帶標簽表達，金斯瑞能純化么？

  我們可以通過離子交換層析，疏水層析和分子篩層析等方法嘗試純化，如果您后續能接受小標簽，比如6*His，建議還是嘗試帶標簽表達，在標簽親和純化基礎上拿到高純度蛋白會更容易。

• 金斯瑞包涵體純化是先純化還是先復性？復性是采用什么方法？客戶送包涵體，讓金斯瑞復性，能夠接單嗎？

  我們一般是先純化后復性，復性步驟我們會篩選不同緩沖液進行蛋白復性實驗，直到選擇到合適緩沖液，使蛋白達到接近天然的狀態。不單獨承接包涵體復性服務。

• 客戶的蛋白容易降解，金斯瑞在純化時怎么處理？

  在純化過程中我們會添加蛋白酶抑制劑，并且純化手段會采用較溫和的方法進行，比如用裂解酶代替超聲破碎，并且會在低溫下快速操作，在較短時間內純化到蛋白。如果有必要，我們會采用多步純化，以拿到更高純度的目的蛋白。

• 客戶需要蛋白有活性，金斯瑞保證么？金斯瑞會通過哪些方法盡可能獲得活性蛋白？

  由于影響蛋白活性的因素有很多，所以，我們無法保證蛋白的活性，但是我們會通過蛋白分析給出您在表達和純化中的建議，盡量獲得活性蛋白。

• 抗體純化你們采用什么純化方法？

  一般采用Protein A或者Protein G純化。

• 內毒素是如何控制的？金斯瑞的內毒素水平能做到什么標準？

  蛋白部原核系統去除內毒素有三個水平<1EU/μg（1000EU/mg）、<0.1EU/μg（100EU/mg）、<0.01EU/μg（10EU/mg），1EU/mg較難做到，哺乳動物細胞表達系統做到1EU/mg容易一些，抗體可以做到0.5EU/mg，應用于小鼠的典型控內毒蛋白需求是<3 EU/mg，應用于人的典型控內毒蛋白需求是<1 EU/mg。哺乳動物細胞表達的內控標準是10EU/mg，但金斯瑞不默認檢測內毒素含量，如果客戶要求最終提供內毒素QC數據，如果客戶有內毒素控制需求，需要在實驗開始前提出。 通過控制試劑，容器以及表達純化過程中的內毒素引入來控制內毒素水平。如果內毒素水平仍然較高，可以通過去內毒的柱子或是離子柱進一步去除。

• 蛋白純度最高可以做到多少？蛋白純化后對應純度蛋白應用有哪些？如50%純度蛋白有哪些實驗應用？80%、90%、95%蛋白可應用于哪些實驗？

  純度可以達到95%，Biacore和結晶對純度要求較高，一般要求高于90%純度，很難根據純度界定應用。

• 發酵業務，工藝優化包括哪些方面？

  包含溫度，時間，誘導條件，溶氧，補料。

• 金斯瑞常用蛋白復性方法？

  需要根據蛋白質序列和結構特性選擇特定的復性策略，比如：1）直接稀釋，2）透析和滲濾，3）小分子助劑：變性劑，氨基酸，聚合物：膠束和脂質體，酒精，還原/氧化試劑，鹽：NaCl/KCl/MgCl2和(NH4)2SO4，糖：葡萄糖、蔗糖和海藻糖等，4）分子伴侶，5）基質輔助方法：SEC、HIC、親和柱和IEC，6）梯度方法。

• 離子柱或者Flag標簽蛋白純化費用是多少？

  根據純化蛋白的量決定，費用比常規His或者GST純化要貴。

蛋白標簽

• 對于蛋白表達和純化，金斯瑞建議引入什么標簽？為什么常推薦客戶使用His標簽？哪些標簽有利于提到蛋白可溶性？

  常用的標簽有His, GST, MBP, Trx, TF, MBP, Nus, SUMO, Flag和Fc等。金斯瑞專家會根據蛋白的性質以及客戶的特殊要求推薦不同的標簽。單獨的His標簽或者His與其它標簽的混合（比如His-GST）是常用的純化標簽。

  His標簽較小，一般對下游應用影響不大。且后期純化成本低。有利于提高蛋白可溶性的標簽有: GST, MBP, Trx, TF, MBP, Nus, SUMO等。

• 金斯瑞能否在蛋白純化后去除標簽？如果可以，費用和周期如何？金斯瑞標簽酶切的費用為何比其它公司高出1-2倍？能保證最終的酶切回收結果么？

  金斯瑞能對在標簽旁引入了蛋白酶切位點的純化蛋白進行標簽去除。具體價格和周期，請咨詢我們的技術支持。 一般我們會先進行小試酶切確定放大的可行性、估算回收率，也減少您費用較高拿不到蛋白的風險。

• 在標簽和目的蛋白之間，金斯瑞推薦引入什么蛋白酶切位點？

  如果需要去除標簽，金斯瑞建議在標簽和目的蛋白之間引入腸激酶，凝血酶，TEV蛋白酶，3C蛋白酶（精密蛋白酶）或SUMO蛋白酶切位點。

• 金斯瑞建議在蛋白N端還是C端引入標簽和蛋白酶切位點？

  我們建議在蛋白N端引入蛋白酶切位點和標簽，而不是在C端引入，因為C端標簽經蛋白酶酶切后會殘留4-6個氨基酸。

• 重組蛋白N端標簽經什么蛋白酶酶切后不會殘留氨基酸？

  重組蛋白N端標簽經EK酶和SUMO酶酶切后不會殘留任何氨基酸，經TEV酶切后會殘留一個甘氨酸"G"或"S"，經3C蛋白酶（精密蛋白酶）酶切后會殘留一個甘氨酸"G"和一個脯氨酸"P"。

• 金斯瑞為什么不能直接給出酶切放大的費用？

  我們在酶切放大前建議先進行酶切小試，摸索最佳酶切比例及酶切條件；如果酶切小試效果較好，我們可以根據酶切小試的結果以及您后續需要的tag free蛋白量進行評估報價。如果酶切小試效果不好，不建議進行后續的酶切放大。

• 為了提高溶解度，金斯瑞最常使用哪些標簽？金斯瑞最常使用什么標簽進行純化？

  通常，我們在使用哺乳動物表達產生重組蛋白時不會遇到不溶性問題。大多數時候，哺乳動物細胞中產生的蛋白質是完全加工的分泌蛋白質，因此沒有不溶性問題。對于困難蛋白質諸如膜蛋白，我們通常使用含有去污劑的商業試劑來裂解細胞以用于檢測和定量目的。常規使用的標簽包括His標簽、Fc融合標簽和Flag標簽。

• 金斯瑞通常會建議蛋白添加標簽表達的原因？

  金斯瑞有成功表達純化無標簽蛋白的經驗，但是，為了提高蛋白的表達、方便后續蛋白的純化，金斯瑞會在征得客戶許可前提下，帶標簽進行蛋白表達。

• 對于昆蟲系統，常用促溶標簽有哪些？常用的純化標簽?

  促溶標簽有GST。常用的純化標簽有His標簽。也可以使用Flag、Fc、GST標簽。

• HA標簽氨基酸序列是?

  HA標簽序列是"YPYDVPDYA"。

• 在哺乳動物系統中，常用的標簽和蛋白酶切位點有哪些？

  常用標簽有Fc、MON-Fc、His和Flag標簽。添加Fc標簽以提高表達水平。MON-Fc是改進的Fc，可用于降低Fc融合蛋白的聚集。His和Flag標簽是小標簽，可以用于親和純化。TEV和腸激酶位點是常用的蛋白酶位點。腸溶激酶位點在去除標記物后不會引入氨基酸殘留，但其酶特異性不如TEV。

蛋白QC

• 如何確定蛋白的純度和質量？

  蛋白純度檢測方法：a. SDS-PAGE, b. HPLC, c. 銀染法，默認使用SDS-PAGE。

  蛋白濃度檢測方法：a. Bradford蛋白測定法; b. BCA蛋白分析法；默認使用bradford, 如果buffer中有影響成分會采用BCA；抗體都是A280檢測。

• 金斯瑞會檢測蛋白產品的內毒素水平么？

  通常我們不會檢測蛋白產品的內毒素水平，但會根據客戶要求，檢測并去除蛋白產品的內毒素。此服務需額外收費。其中內毒素控制和去除服務，需要在項目開展前提出，因為控制和去除內毒素的操作是在表達和純化過程中進行的。

• 蛋白表達服務會交付哪些QC數據？純化后的蛋白金斯瑞是否要做序列驗證？如果不做，如何保證拿到的蛋白是客戶的目的蛋白？

  金斯瑞蛋白表達鑒定提供的免費QC數據包括SDS-PAGE和Western blot檢測結果（His抗體、GST抗體或者其他抗體）。金斯瑞純化蛋白提供的免費QC數據只有SDS-PAGE，客戶可以訂購其它額外收費的QC檢測服務，比如Western blot，HPLC，LC-MS和N-Terminal Sequencing。

  純化后對于大小無異常蛋白不做序列驗證。

  如需進一步驗證可以訂購蛋白覆蓋率檢測服務。

• 對于桿狀病毒制備服務（SC1261），金斯瑞會交付哪些QC數據？

  我們通過Western blot（His抗體、GST抗體或者其他抗體）檢測P1和P2病毒儲液蛋白表達情況，通過qRT-PCR檢測病毒的滴度。最終的QC文件包含qRT-PCR和Western blot結果。

• 客戶表達的蛋白沒有標簽，金斯瑞采用什么方法QC？

  我們的QC首先會有SDS-PAGE，如果您能提供蛋白的特異性抗體，我們可以為您進行WB檢測。對于純化后的tag free蛋白，我們還可以進行肽段覆蓋率檢測，以確認純化到的蛋白是目的蛋白（該項檢測可能會額外收費）。

• 金斯瑞在做SDS-PAGE和western時，蛋白上樣量是多少？

  這取決于目的蛋白的濃度。一般QC我們會上樣2ug做純度檢測。

• 金斯瑞發貨報告中會有詳細的實驗步驟嗎？

  最終的發貨報告中不包含詳細的實驗步驟。如果需要詳細步驟，如要額外收取費用。

蛋白運輸和保存

• 桿狀病毒產品的最適運輸條件以及長期保存條件分別是什么？運輸緩沖液與長期保存緩沖液是否有差別？病毒液如何保持效價？金斯瑞昆蟲細胞表達交付的病毒低度范圍？病毒是否可以風干保存？

  桿狀病毒運輸溫度是4℃，保存緩沖液是Sf-900 II SFM和2% FBS。桿狀病毒的長期保存條件是-80℃凍存。但是，隨著每一次凍融，病毒滴度會降低50%。所以對于常規使用，我們建議將病毒分裝，并在4℃避光保存。桿狀病毒在4℃條件下建議保存3個月，最多可保存6個月。

  病毒默認交付>10^8pfu/ml（病毒測定方法：Q-PCR）。不可風干保存。

• 客戶想后續訂購大規模蛋白產品，但不是現在。金斯瑞能為客戶保存表達載體多長時間？

  訂單發貨后，金斯瑞會免費為客戶保存蛋白表達菌株3個月，大腸桿菌，昆蟲和表達系統的相關表達載體我們會免費保存2年以上。但是，如果客戶沒有要求我們為他/她保存載體，我們可能會銷毀相關產品并且不負任何責任。

• 金斯瑞運輸蛋白的默認緩沖液是什么？如果客戶后續要更換為其他緩沖液，要怎么操作？

  Tris-HCl, pH 7.5-9.0或者PBS, pH 7-8，含5-20%甘油、0-600mM NaCl以及少于5mM DTT, 0.5M L-Arg。如果緩沖液中需要用到以下試劑：0.3% SKL和1% SDS，我們將會與客戶聯系確認。

  如果您收到蛋白后希望更換緩沖液，可以采用透析的方法置換。建議先做小量透析確定蛋白在您需求的buffer中穩定，再進行放大，以免蛋白全部損失。

• 金斯瑞提供的蛋白產品是以凍干形式還是液體形式發貨？

  默認以液體形式發貨。根據客戶實際需求，我們可以發貨凍干蛋白，但是需要額外收費。

• 通常，金斯瑞建議蛋白在什么條件下保存？

  請將蛋白等量分裝，在-80℃或液氮中長期貯存，并且要避免多次凍融。

慢病毒包裝問題

• 金斯瑞提供慢病毒包裝的過程是怎樣的，以及QC檢測有哪幾項：

  plenti載體構建---plenti質粒與輔助質粒共轉293T細胞----上清收集---病毒純化、濃縮---滴度測定，支原體檢測。

  QC檢測包括：病毒滴度p24 ELISA 檢測，支原體Lonza 180檢測。

• 金斯瑞提供慢病毒的包裝使用的載體與細胞系是什么，是否可以提供給客戶？

  金斯瑞使用慢病毒包裝的質粒為plenti系列的質粒，包括單質粒系統與雙質粒系統，可以根據客戶的需求進行選擇，但是有專利限制，目前還不是IPfree狀態，因此不能交付plenti系列的質粒,但是可以交付帶有客戶目的序列的克隆載體（pUC57）。如果客戶希望自己提供質粒，由金斯瑞提供病毒包裝服務，可以讓客戶提供載體的全序列，提交給項目經理進行評估。

  	單質粒系統	雙質粒系統
  	Cloning vector	Cloning vector	Co-delivered vector
  病毒載體	pLentiCRISPR v2	pLentiGuide-Puro	pLentiCas9-Blast pLentiCas9-EGFP plentiCas9n(D10A)-Blast
  		lenti sgRNA(MS2)_zeo	Lenti dCAS-VP64_Blast Lenti MS2-P65-HSF1_Hygro Lenti dCAS9-VP64 GFP Lenti MS2-P65-HSF1_GFP
  	pX601 (AAV)	pAAV SpCas9 acceptor (PX552)	pAAV-SpCas9 (PX551)
  	只需一步感染細胞 細胞系構建周期短，可用于原代細胞系，iPS等	需要兩步感染細胞，先構建穩定表達Cas9的細胞系

• 金斯瑞使用什么方法檢測慢病毒的滴度。

  金斯瑞使用P24 ELISA的方法測定慢病毒滴度。p24蛋白是慢病毒外殼中含量最大的標志性蛋白，一個慢病毒顆粒（Lentiviral Particle, LP）中約有2000個p24蛋白分子，通過ELISA方法檢測P24蛋白分子含量以確定病毒的滴度。該方法檢測病毒滴度的穩定性要高于qRT-PCR。

• 慢病毒保證服務，可以承接的客戶目的基因的大小與價格體系。

  慢病毒載體可容納<4kb的目的基因。
  生產提供的交付結果以及如果包裝失敗的解決方式：
  Gene Length<1500bp，金斯瑞保證至少107IFU/ml， 低于107IFU/ml則免費重新包裝一次，并以最高滴度發貨，費用按照實際滴度對應價格收取。若兩次都低于107IFU/ml，則不收取包裝費。 1500pb≤Gene Length<3000bp，金斯瑞保證至少107IFU/ml ， 低于107IFU/ml則免費重新包裝一次，并以最高低度發貨，費用按照實際滴度對應價格收取 。若兩次都低于107IFU/ml ，則只收取訂單價格50% 費用。
  3000 pb≤Gene Length<4000bp，金斯瑞保證至少106IFU/ml ， 低于106IFU/ml則免費重新包裝一次，并以最高滴度發貨，費用按照實際滴度對應價格收取 。若兩次都低于106IFU/ml ，則只收取訂單價格50% 費用。