行業(yè)洞見
細胞治療 & CAR T療法定義
- 細胞治療：利用患者自體（或異體）的成體細胞（或干細胞）對組織、器官進行修復(fù)的治療方法，用于骨髓移植、晚期肝硬化、股骨頭壞死、惡性腫瘤等疾病。其中，以CAR T為代表的細胞治療在血液腫瘤治療領(lǐng)域中取得了備受矚目的優(yōu)異療效。
- CAR T療法：通過基因工程技術(shù)，在激活的T細胞上安裝定位導(dǎo)航裝置CAR（腫瘤嵌合抗原受體），特異識別體內(nèi)腫瘤細胞，并通過免疫作用釋放大量的多種效應(yīng)因子，高效地殺滅腫瘤細胞。
CAR T療法上市產(chǎn)品與適應(yīng)癥
- FDA已批準(zhǔn)6款CAR T上市藥物：
- Kymriah-諾華：B細胞急性淋巴細胞白血病、彌漫性大B細胞淋巴瘤
- Yescarta-吉列德/Kite：大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤
- Tecartus-吉列德/Kite：套細胞淋巴瘤
- Breyanzi-百時美：彌漫大B細胞淋巴瘤
- Abecama-百時美/藍鳥：多發(fā)性骨髓瘤
- 西達基奧侖賽-傳奇生物：復(fù)發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤
- 中國國家藥監(jiān)局已批準(zhǔn)2款CAR T上市藥物：
- 益基利侖賽注射液-復(fù)星凱特：難治性大B細胞淋巴瘤
- 瑞基奧侖賽注射液-藥明巨諾：大B細胞淋巴瘤
另外，全球還有6款藥物已注冊，市場未來5-6年內(nèi)預(yù)計市場上會出現(xiàn)約12款CAR T藥物。
CAR T療法開發(fā)路線與重點
- CAR T 開發(fā)路線
- CAR T 開發(fā)重點
- 高效的CAR結(jié)構(gòu)：針對腫瘤細胞的特異性高，避免脫靶毒性導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副作用
- 合理的共刺激結(jié)構(gòu)域：提高T細胞增殖活性、腫瘤細胞殺傷力，延長T細胞存活時間
- 精準(zhǔn)的遞送方案：準(zhǔn)確高效的將CAR序列整合至T細胞、規(guī)避脫靶
CAR T療法新突破方向
- 攻克實體瘤領(lǐng)域應(yīng)用的瓶頸
- 探索放大規(guī)模、降低成本的工藝
- 提升CAR T細胞體內(nèi)的持續(xù)性
- 降低細胞因子風(fēng)暴的副作用
- 開發(fā)通用型CAR T、CAR NK細胞、雙靶點CAR結(jié)構(gòu)域、與免疫抑制劑等聯(lián)用增效
CAR T療法研發(fā)流程
CAR候選分子發(fā)現(xiàn)
CAR T免疫治療通過CAR識別腫瘤細胞，并釋放細胞因子，發(fā)揮抗腫瘤作用。CAR主要由胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。胞外結(jié)構(gòu)域中的單克隆抗體的單鏈可變片段（scFv）可決定抗原的特異性和親和力，跨膜結(jié)構(gòu)域可影響CAR在細胞表面表達，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中共刺激域與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域則起到信號活化轉(zhuǎn)導(dǎo)使T細胞發(fā)揮殺傷力的作用。其中，特異性好、親和力高的抗體制備工藝，將有助于篩選到副作用小、殺傷作用強的CAR序列。
關(guān)鍵點：如何構(gòu)建特異性好的抗原識別結(jié)構(gòu)域（scFv）？
方案：抗體篩選流程與金斯瑞解決方案
金斯瑞優(yōu)勢：
- 抗原制備平臺：專利設(shè)計軟件、難度項目交付能力、高標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量
- 鼠/兔快速免疫平臺：獨特的抗原修飾技術(shù)，打破免疫耐受
- B細胞克隆平臺：快速免疫、高親和力、高多樣性
- 重組抗體表達平臺：表達量高、一致性好、嚴(yán)控內(nèi)毒
- ScFv優(yōu)化平臺：精準(zhǔn)突變文庫更經(jīng)濟、5-10倍親和力提升、避免人抗鼠抗體反應(yīng)
金斯瑞案例：
金斯瑞MonoRab?兔單克隆抗體親和力高
（Biacore檢測抗原-抗體親和力）
金斯瑞MonoRab?兔單克隆抗體多樣性好
（表位歸類）
實驗結(jié)果：表位歸類結(jié)果表明16個克隆分屬于11個不同的表位，表明金斯瑞MonoRab?兔單克隆抗體多樣性好。其中2F8抗體KD可達10-12M，表明其親和力高。
*金斯瑞可交付KD數(shù)值高達10-10M水平的鼠單克隆抗體，親和力高、多樣性好，易于后續(xù)人源化開展。
CAR T細胞構(gòu)建
在將CAR序列整合至T細胞的過程中，利用病毒遞送基因，存在CAR序列會隨機插入細胞基因組任意位置的風(fēng)險。可能干擾整個基因組功能、影響隨機插入位點附近的功能基因表達。
CRISPR基因編輯技術(shù)具有優(yōu)越的靈活性與編輯效率，較之慢病毒轉(zhuǎn)染遞送序列的方案，CRISPR不僅可以更安全的實現(xiàn)在特定位點插入CAR序列，還可以敲除PD1、TRAC、TRBC等多個基因，同時工藝更簡單經(jīng)濟。目前，“CAR T之父”Carl H. June教授在內(nèi)的一些團隊已經(jīng)在臨床試驗中獲得了部分基于CRISPR技術(shù)制備的CAR T細胞安全有效的證據(jù)。這些優(yōu)勢使得CRISPR技術(shù)在下一代CAR T細胞制備工藝中展現(xiàn)出巨大潛能。編輯效率高、脫靶效應(yīng)低、細胞毒性低的CRISPR試劑將使該技術(shù)路線如虎添翼。
關(guān)鍵點：如何高效精準(zhǔn)的將CAR整合至T細胞基因組？
方案：CRISPR技術(shù)編輯T細胞流程與金斯瑞解決方案
(點擊服務(wù)名稱了解詳情)
Tips：基于CRISPR技術(shù)的CAR序列整合方案的優(yōu)勢
- 更安全！可將CAR序列插入到特定的位點，例如T細胞受體位點（TRAC）、任何基因組上的安全港位點
- 更高效！可敲除T細胞天然受體和PD-1免疫檢查點，增強T細胞活性和持久性
- 更簡單！實驗操作簡單，更易于后續(xù)GMP工藝開發(fā)與成本優(yōu)化
金斯瑞優(yōu)勢：支持科研至IND申報需求
- EasyEdit sgRNA：篩選階段-細胞毒性低、編輯效率高、更穩(wěn)定、更快更經(jīng)濟、即買即用
-
SafeEdit sgRNA：驗證階段-細胞毒性低、編輯效率高、更穩(wěn)定、HPLC純化、定制化QC
- GenExact™ ssDNA：長單鏈DNA，細胞毒性低、脫靶效應(yīng)低、敲入效率高，提供科研至臨床前研究級
- GenWand™ dsDNA：雙端共價封閉雙鏈DNA，2-10 kb長基因敲入、μg-g交付量、敲入效率高，提供科研至臨床前研究級
- iGUIDE脫靶分析：根據(jù)細胞內(nèi)真實脫靶情況檢測更準(zhǔn)確，依托NGS平臺靈敏度高，基于金斯瑞優(yōu)化的dsODN tag，降低假陽性
金斯瑞案例：
金斯瑞EasyEdit sgRNA編輯效率高 (VS IVT sgRNA)
金斯瑞-GenExact™ ssDNA敲入效率高
合作伙伴
- 提供匹配臨床研究與申報要求的基因編輯關(guān)鍵原料sgRNA
- 擬合作制定基因細胞治療領(lǐng)域關(guān)鍵原材料行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)
戰(zhàn)略合作！金斯瑞B(yǎng)asic GMP sgRNA支持北恒生物通用型CAR T申報
- 較之實驗室合成的HDR模板，細胞毒性低、敲入效率高
- GMP適用規(guī)模的GenExact? ssDNA制備的BCMA-CAR細胞可達到患者使用劑量（1.5 x 109）、并表現(xiàn)出腫瘤殺傷活性
CAR敲入效率46.2%！金斯瑞GenExact? ssDNA支持BCMA-CAR臨床試驗
CAR T功能驗證
構(gòu)建完成的CAR T細胞即可進入功能驗證環(huán)節(jié)，例如通過CAR表達量檢測確認效應(yīng)CAR T細胞制備效果、通過腫瘤細胞殺傷實驗檢測CAR T細胞體外藥效、通過模式動物評估CAR T細胞體內(nèi)安全性與藥效、通過監(jiān)控體內(nèi)CAR T細胞含量變化考察藥代藥動信息等等，這些都將為CAR T細胞的成藥性提供重要依據(jù)。金斯瑞細胞系構(gòu)建服務(wù)可以提供檢測模型、抗獨特型抗體服務(wù)可以提供檢測試劑，支持功能驗證階段的不同CAR T細胞的定制化需求。
關(guān)鍵點：如何評價CAR T細胞對腫瘤殺傷活性？
方案：構(gòu)建細胞系驗證CAR表達/CAR T對腫瘤細胞殺傷活性
(點擊服務(wù)名稱了解詳情)
金斯瑞優(yōu)勢：2,000+穩(wěn)定細胞系交付經(jīng)驗，400+抗獨特型抗體項目交付經(jīng)驗
- 細胞系構(gòu)建平臺：嚴(yán)格的合規(guī)性 ( ISO 9001: 2015、BSL2實驗室 )、清晰的細胞/質(zhì)粒IP與實驗記錄、高標(biāo)準(zhǔn)QC（180種常見支原體檢測）
- 抗獨特型抗體平臺：從抗獨特型抗體發(fā)現(xiàn)到PK和ADA試劑盒開發(fā)與生產(chǎn)、保證交付即用PK和ADA檢測試劑盒、可合規(guī)用于臨床樣品檢測
金斯瑞案例：
構(gòu)建表達細胞系-通過FASC檢測熒光值檢測不同CAR序列表達量
構(gòu)建效應(yīng)/靶細胞系-檢測不同CAR序列的CAR T細胞對腫瘤細胞殺傷活性
結(jié)論：CAR1序列表達量更高、殺傷效果更優(yōu)好，可作為候選序列開展后續(xù)開發(fā)工作
CAR NK/CAR M新方向
CAR T細胞在臨床抗腫瘤、尤其是血液腫瘤領(lǐng)已經(jīng)取得了豐碩成果，然而現(xiàn)階段仍存在抗實體瘤的局限、細胞因子風(fēng)暴等副作用、制備周期和費用成本較高等問題，也催生了以CAR NK、CAR 巨噬細胞等新方向的研究快速發(fā)展，這些新方向又有什么與眾不同的特點呢？
CAR NK
NK細胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染或基因編輯添加CAR結(jié)構(gòu)后，同樣能夠特異識別腫瘤細胞，通過釋放殺傷介質(zhì)、誘導(dǎo)靶細胞凋亡等途徑殺傷腫瘤細胞。FDA已批準(zhǔn)臨床多個CAR NK在血液腫瘤與實體瘤中臨床研究，CDE也于2021年11月批準(zhǔn)首個“現(xiàn)貨型”異體來源的CAR-NK產(chǎn)品的臨床試驗申請，用于治療晚期上皮性卵巢癌。
CAR NK的特點：
- 來源廣泛：可來源于外周血、臍帶血、 誘導(dǎo)多能干細胞（iPSC）、NK細胞系。其中，iPSC來源具有供體細胞需求量少，成本低，可無限培養(yǎng)，免疫原性較低等優(yōu)點。
- 安全性高：NK細胞分泌IL-3和GM-CSF等，造成細胞因子風(fēng)暴的可能性較小。NK細胞存活時間更短、產(chǎn)生未知副作用的風(fēng)險小。
- 快速高效：不受MHC識別的限制，可通過天然受體識別和靶向腫瘤細胞，快速殺傷腫瘤細胞，降低腫瘤細胞逃脫的可能性，有效殺傷長期治療后可能改變表型的殘留腫瘤細胞。
- 現(xiàn)貨性產(chǎn)品：異體NK細胞移植幾乎不會誘發(fā)移植物抗宿主病（GVHD），分泌PD-1的水平較低，具有開發(fā)“現(xiàn)貨型”產(chǎn)品的潛力。
CAR NK的挑戰(zhàn)：
- 增殖潛力有限：單個供體的NK細胞數(shù)量少，NK細胞細胞分裂次數(shù)有限，通常需要2-3周時間來培養(yǎng)NK細胞，難以擴增至輸注所需的大量細胞，可考慮通過iPSC里獲得更大量的NK細胞。
- CAR導(dǎo)入困難：病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)NK細胞效率較差、同時可能引起隨機插入，mRNA/轉(zhuǎn)座子被認為是一種安全的轉(zhuǎn)染方法，CRISPR定點敲入CAR序列也是一個新思路。
- 相關(guān)服務(wù)： CRISPR/Cas9 sgRNA合成服務(wù)、 HDR基因敲入模板 、 質(zhì)粒制備服務(wù)、 慢病毒包裝服務(wù)
- 持續(xù)性較短：NK細胞的存續(xù)時間有限，雖有助于它們的安全性，但也縮小了治療窗口。
- 凍融敏感：解凍后NK細胞的存活率和細胞毒性顯著降低，可能會影響其運輸、儲存和現(xiàn)貨性產(chǎn)品開發(fā)，需要探索對NK細胞影響較小的凍融步驟。
CAR 巨噬細胞
巨噬細胞是人體免疫中核心細胞之一，具有對體液和組織中的細胞殘片及病原體的吞噬及消化作用，并通過抗原呈遞功能激活淋巴球或其他免疫細胞，使其對病原體作出反應(yīng)。添加CAR后的巨噬細胞能夠準(zhǔn)確識別腫瘤細胞，進而吞噬腫瘤細胞，同時表達促炎細胞因子和趨化因子，將“旁觀者”M2型巨噬細胞轉(zhuǎn)化為M1型 。CAR-巨噬細胞還可以將癌細胞抗原碎片呈遞給T細胞，激活T細胞，并抵抗免疫抑制細胞因子的作用。
2021年9月23日，CARISMA Therapeutics宣布美國FDA已授予該公司靶向人表皮生長因子受體2 (HER2) 的嵌合抗原受體-巨噬細胞(CAR-M)療法CT-0508快速通道資格，用于治療實體瘤。
