主要用于全蛋白掃描，為篩選線性或連續性表位提供理想工具。根據目的蛋白或長肽設計關鍵短肽序列，可用來鑒定蛋白活性、免疫特異性以及抗體結合性。重疊肽庫的設計主要由肽鏈長度和步移（offset number）兩個參數決定，從目的蛋白N端逐步向C端截取設計，每次轉移一個或幾個氨基酸，序列之間有部分重合，最終形成重疊肽庫。
選擇合適的步移和肽段長度可以降低實驗成本，同時使數據價值最大化。步移通常設計為肽段長度的1/3。長肽段會包含更多的表位，但是一般這類肽段很難合成，并且庫中包含的肽段變少。短肽段更容易合成，也更便宜，但每肽段的表位較少。短步移數和短肽組合可以形成最多數量的多肽，而長步移數與長肽組合產生的多肽數量最少。
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