PCR克隆及亞克隆FAQ

• Q1：如需做克隆及亞克隆，我需要提供什么模板？如提供PCR產物，該如何處理？

  通常您需提供的模板是含有目的基因的質粒或菌液，且插入片段已經過測序驗證。如提供PCR產物，由于PCR產物容易降解，我們建議您先做TA克隆，將PCR產物裝在T載體上，再進行測序驗證，以含有目的基因的T載體作為亞克隆模板，這樣成功率較高。

• Q2：做亞克隆服務需提供哪些材料和信息？

  需提供以下材料和信息：

  • 目的基因序列，如果該目的基因經過測序，需要您提供測序彩圖文件（abi格式）；
  • 含有目的基因的模板質粒或菌液，以及模板質粒的大小、抗性、圖譜等相關信息；
  • 目標載體及相關信息：如果目標載體為商業化空白載體，需要提供載體全稱；如果目標載體經過改造，需要提供載體全序列；
  • 亞克隆方式：即利用哪兩個酶切位點將目的基因亞克隆至目標載體。
• Q3：金斯瑞交付哪些結果？提供給我的數據報告包括哪些內容？

  交付結果包括：

  • 實物發貨：4μg凍干質粒DNA（低拷貝1μg凍干質粒DNA），1管穿刺菌；
  • 數據報告：測序結果、測序結果和目的序列的比對文件、QC報告、質粒結構圖。如果您需要提供甘油菌，需要在安排訂單時注明。
• Q4：哪些類型載體的亞克隆難度比較大？

  載體比較大、低拷貝載體、背景不明確的載體、自殺性載體和抗性特殊的載體，亞克隆難度比較大。例如：pCAMBIA-1301、pBI121、pKSV7、pMG36e（紅霉素抗性）和pCYT（氯霉素抗性）等。

• Q5：什么叫甲基化現象？

  甲基化現象是一種表觀遺傳修飾，它是由DNA甲基轉移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶的一種反應，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是存在的化學性修飾堿基，CG二核苷酸是主要的甲基化位點。一般說來，DNA的甲基化會抑制基因的表達，DNA的甲基化對維持染色體的結構、X染色體的失活、基因印記和腫瘤的發生發展都起重要的作用。

• Q6：什么叫移碼現象？在設計亞克隆方案時如何避免移碼？

  移碼現象是由于基因中增加或減少1~2個堿基（改變的堿基數不是3或3的倍數）使該位點后面的DNA序列發生移碼，結果導致不能順利表達出目的蛋白。我們在設計亞克隆方案時應注意：a.酶切位點的選擇，如NcoI（CCATGG），由于其中有一個起始密碼子，很容易產生移碼，所以，在使用這類酶切位點時應謹慎，應添加移碼保護堿基；b.盡量利用載體上已有的序列。