什么是ELISA？

ELISA是酶聯免疫吸附測定法（ELISA）的縮寫。ELISA在科研、醫療保健和食品健康環境中常用于測量目標分析物（如激素、抗體和蛋白質生物標記物等）。在ELISA中，分析物是抗原，即抗體的靶標。抗原通常被吸附（附著）在96孔板上，并被免疫球蛋白（抗體）特異性識別，免疫球蛋白（抗體）上帶有用于檢測的酶。ELISA測定有多種變化形式，但基本要求不變：

• 固相：提供一種將溶液中的結合伙伴與未結合分子分離的方法。通過吸收或附著在塑料96孔板上實現。
• 抗原：抗體的結合伴侶或靶點。通常為固相分子。
• 抗體：至少一種對抗原進行特異性識別的多克隆或單克隆免疫球蛋白。
• 檢測：通過某種信號手段量化結合與未結合的抗原或抗體。可選方法包括比色技術、熒光技術或發光技術等。

這些基本要素可以組合成多種形式，包括直接酶聯免疫吸附試驗、夾心酶聯免疫吸附試驗和捕獲酶聯免疫吸附試驗。它們之間的區別在于固定哪種成分、如何識別以及檢測什么。通過5種基本形式的組合可以創造出更為復雜的分析測定，但簡單起見，以下僅列出最基本的測定形式。

多種ELISA測定形式

直接ELISA的形式最為簡單，只需要將抗原吸附在孔板上再與標記“檢測”抗體結合即可。“直接”是指第一個也是唯一一個抗體既是抗原識別分子，又是信號傳遞分子。這與 "間接ELISA不同，后者將檢測和信號傳遞任務分給了"一抗"和"二抗"。間接ELISA使用未標記的抗體來檢測孔板中的抗原，然后通過具有信號傳遞作用的第二抗體（二抗）來檢測第一抗體（一抗）。直接ELISA的突出優勢在于簡單快捷，而間接ELISA雖然在抗原結合與信號檢測之間增加了操作步驟，但依然有著其自身的優點。間接ELISA利用二抗傳遞信號，可以使用模塊化二抗識別一抗的恒定（Fc）區。因此，標記的二抗可用于多種不同的ELISA，而一抗無需修改。一抗通常是單克隆抗體，是一種珍貴且價格高昂的資源，而二抗則通常是多克隆抗體，生產成本低廉而且生產速度快。除了成本之外，這種單克隆一抗與多克隆二抗的組合還能通過信號放大來提升性能。由于多克隆抗體中含有多種不同的克隆，每種克隆只能識別自己的抗原表位，因此多克隆抗體可以結合一抗Fc恒定區上的多個位點。在上述示例中，多個標記多克隆二抗會修飾藍色一抗。直接ELISA的檢測受限于分析測定中唯一抗體的標記程度。在間接ELISA中，一抗能被2到3種多克隆二抗識別，因此每種一抗信號量會增加2到3倍。直接和間接ELISA測定法都可以擴展成為以下討論的所有變化形式。

夾心ELISA的區分特征在于將“捕獲”抗體吸附在孔板上。抗原與平板上的抗體結合或被其捕獲，然后"夾"在捕獲抗體和檢測抗體之間，檢測抗體能識別抗原上截然不同的表位。夾心ELISA的主要優勢在于能夠特異性地檢測不純樣品中的抗原。捕獲抗體不會將粗樣品吸附到平板上，而是提供檢測特異性和去污能力。夾心ELISA當中同樣能夠收獲間接檢測的機會。檢測抗體不會攜帶信號，而是由第三種抗體作為靶點，為分析測定提供信號。

“捕獲”ELISA是一種與夾心ELISA相似的技術，使用親和素-生物素復合物將抗原保留在孔板上。吸附到ELISA孔板時需要一定程度的疏水性相互作用和電荷相互作用，這可能對抗原的結構造成負面影響，從而抑制抗體識別。通過吸附大型四聚體蛋白親和素，可以對生物素標記抗原進行固相，同時避免造成孔板-抗原相互作用。此外，生物素-親和素捕獲可以將抗原與孔板隔開。增加抗原與孔板之間的距離有助于實現對抗原的三維通路建立，而直接涂鍍則可在空間上掩蓋抗原表位的通路。生物素捕獲法還是一種可從復雜樣品中回收生物素化抗原的有利技術。

最后一種可能采用的ELISA類別是“競爭性”ELISA。這種酶聯分析測定與直接ELISA相似，抗原可直接吸附到孔板上。但檢測抗體在涂覆于孔板之前還需要使用抗原數量未知的樣品進行預培養。抗原數量較多的樣品將占據一抗的結合位點，進而阻止一抗與孔板抗原結合。相反，抗原數量較少的樣品將有更多的抗體可用于結合孔板抗原，從而產生更高的信號。在競爭性ELISA中，返回的信號與樣品中抗原-抗體相互作用的集中程度密切相關。因此需要在同一套孔板上滴定數量已知的抗原來建立標準曲線，以便量化未知樣品中的可用抗原。競爭法酶聯分析測定可以與捕獲法及夾心法合并使用。也可采用間接檢測。

如何優化ELISA

ELISA是目前除蛋白質印跡之外最常用也最為靈敏的分子生物學工具之一。ELISA經過妥善優化后，其檢測限正常可精準到抗原的毫微微克量級。與蛋白質印跡法不同，ELISA通過將實驗樣本與在匹配的緩沖液成分（例如，如果實驗樣本為血清，則包括血清）中滴定已知量樣本而形成的標準曲線進行比較，從而提供高度可量化的數據。除了選擇合適的分析測定形式外，ELISA許多步驟中的每一步都是優化的機會。可能需要對以下部分或全部環節開展經驗檢驗，以獲得信噪比最大化：

• 孔板：孔板化學構成的變化可能導致抗原吸附效率的差異化和非特異性結合，從而影響到信噪比。ELISA孔板的幾何形狀也會影響到孔板效率和最終的信號強度。應并排比較不同的板化學成分和幾何形狀，以確定ELISA的最佳做法。如果懷疑孔板化學構成限制了ELISA的性能，則采用捕獲ELISA進行檢驗可能較為實用，因為這種測定形式會杜絕可能存在的表位掩蔽或構象變化。
• 緩沖液：在可能的情況下，保持最佳溫度、pH值和鹽濃度對于實現最佳性能至關重要。此處不僅針對于結合緩沖液，還延伸到包被緩沖液和清洗緩沖液。雖然溫度越高，培養時間越短，但溫度的升高也會增加非特異性結合。有鑒于此，最為合適的做法應為夜間孔板維持室溫，封閉期間維持37攝氏度，結合時再恢復至室溫。另外，保持所有其他條件不變，對各種不同的溫度、pH值、鹽、無關的蛋白質封閉等進行檢驗可確定最佳條件。
• 抗體親和力：ELISA的性能高度依賴于抗體親和力。在濃度匹配的情況下，不同的克隆將表現出優于其他克隆的性能。除了創造或尋找替代抗體外，親和力問題并不容易解決，但滴定濃度可以優化抗體的使用量，在合理的范圍內，甚至可以適應低親和力的抗體。陰性對照相當關鍵，因為抗體濃度的增加同時也會增加非特異性結合的風險。
• 抗體克隆性：使用單克隆或多克隆抗體作為檢測物種將影響到酶聯測定的靈敏度。對于ELISA中的抗體克隆性能能力，目前有兩種競爭性的理論。雖然單克隆抗體具有特異性，但由于表位識別能力有限，通常信號較低。多克隆抗體可以識別每個抗原上更多的表位，但即使是親和性純化的多克隆抗體，也會固有地帶來不必要的潛在交叉反應。以夾心ELISA為例，單克隆捕獲抗體只能從樣品中回收特定的靶點，而多克隆捕獲抗體則會回收最大量的靶點，但同時也會伴隨一定的非特異性結合。以上任意一種抗體在其克隆形成能力的協助下可用作檢檢驗劑，但都要關注同樣的特異性注意事項。樣品質量無疑會影響到ELISA的性能。復雜樣品可在很大程度上受益于單克隆抗體捕獲的特異性優勢，而成分簡單但靶點濃度較低的樣品則可受益于多克隆抗體捕獲。不過仍應強調，經驗檢驗可揭示最理想的克隆使用或者組合使用。
• 信號：酶促信號顯現可提供可靠的檢測，但應注意在淬滅反應前優化顯現時間、溫度和體積。時間太短或溫度太低都有可能減弱信號生成，而時間太長或溫度太高則可能導致噪聲增多。體積通常受限于孔的大小，但一旦優化，也應在整個檢驗和研究期間保持恒定。如果能夠檢測到充足的信號，則熒光報告基因同樣可以用于同時測量多種目標物，而其中檢測抗體的熒光標記則有助于簡化測定方案。

ELISA的應用

除了以上所列應用外，ELISA技術甚至應用到了普通非處方類診斷當中，例如家庭孕檢。這些類型的檢驗又稱為“試紙條”ELISA測定，其中利用了側向流動和夾心ELISA原理。先在毛細管作用下抽樣，樣品通過含有未結合檢測抗體的區域，再通過含有固相捕獲抗體（同樣特異于被分析物）的區域。雖然這種簡化版的ELISA不能提供可量化的結果，但它速度快、成本低，非常適合在護理點和家庭檢測環境中使用。

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