并非所有抗體都適用于每種實驗和條件，它們必須針對特定應用和物種進行驗證。目前還沒有“抗體驗證”的標準方法，這極大地影響到了實驗的重現性和可靠性。科研期刊和資助機構采取了多種措施來彌合這一差距?，F在，很多機構要求明確說明如何驗證特定用途的抗體。遺憾的是，抗體驗證依然沒有普遍公認的標準。因此，研究人員需要自行決定驗證每一種抗體是否能夠有效滿足預期應用。
標準抗體驗證方法包括蛋白質印跡、ELISA、流式細胞計和IHC。絕大多數研究人員對這些檢測方法較為熟悉。驗證過程可能較為耗時，因為研究人員或生產商必須驗證抗體是否有效滿足每一種應用。由于每種檢測的條件都不相同，因此難度更大。例如，蛋白質印跡依賴于蛋白質的變性。因此，通過蛋白質印跡驗證的抗體在變性條件下可有效發揮作用，但可能無法識別原生構象的抗原（即ELISA）。1同樣，通過原生蛋白質親和力驗證的抗體也無法結合變性或固定后的同一種抗原。
以上方法在抗體驗證中發揮著不可或缺的作用。但我們不能完全依賴這些方法，因為它們并不能代表不斷擴大的應用領域。通過采用其他驗證技術，可以提高抗體驗證的可信度。
為了針對解決基本抗體驗證的種種不足，一群科學家最近聚集在一起，“為抗體驗證提出了一系列標準指南”。2他們建議，除了基本的抗體驗證方法外，研究人員應開始仰仗其他概念性支柱。這其中包括遺傳策略、獨立抗體策略和標記蛋白質表達。2
遺傳策略：CRISPR-Cas9以及其他更多
基因策略包括CRISPR-Cas9，RNAi和siRNA基因敲除等技術，并與蛋白質檢驗結合使用。這些方法在敲除或敲低適當的基因后可檢測出被研究抗體的任何非特異性結合。如果抗體具有特異性，則在敲除和敲低的細胞系中應分別檢測到該抗體無信號或信號減弱。
獨立抗體驗證法
獨立抗體的使用是另一種能夠檢測出非特異性結合的方法。獨立抗體法采用兩種不同的（獨立的）抗體，它們結合相同的抗原但表位不同。因此，這兩種抗體均應表現出相同的檢測規律且不存在脫靶結合。2此項技術要求使用多份樣品進行檢驗，以便與可變目標蛋白表達形成對照，因此變得非常耗時且成本高昂。此外，該驗證技術還依賴于可在同一目標蛋白上識別不同表位的多種抗體的可用性。金斯瑞在其單克隆抗體開發服務中提供了表位分選，包括用于蛋白質抗原的“獨立抗體”。
標記蛋白質表達
分析標記目標蛋白的檢測情況也是測量抗體非特異性結合的一種方法。該方法使用親和力標記（即FLAG）或熒光蛋白（即GFP）來對目標蛋白進行修飾。然后，與獨立抗體驗證法相似，用接受驗證的抗體的檢測規律與標記特異性抗體的檢測規律進行比較。雖然比較直觀，但該方法存在的一個問題是如何確保標記蛋白質的表達可達到內源性水平，因為“過表達會掩蓋脫靶結合事件的檢測”。2
重組抗體用于替代單克隆抗體？
最近一項關于抗體驗證的行動呼吁與建議研究人員只使用重組抗體，而不是多克隆甚至單克隆抗體。單克隆抗體的生產制備使用雜交瘤細胞系。遺憾的是，雜交瘤細胞系會全部死亡、會丟失抗體編碼基因、或者從冷凍保存中取出時便停止生長。3此外，雜交瘤生成的單克隆抗體會與不止一個標靶相結合。因此，為雜交瘤編碼的抗體確定序列并通過重組方式生成抗體才能克服這些問題。再者，與單獨使用上述驗證方法相比，重組抗體由于存在明確定義的序列而能夠提供另一層的驗證。3
這些額外的驗證方法建議 "提供抗體與其靶標結合的證據，在大多數情況下，它們還應該允許在測試條件下評估潛在的交叉反應"。2但舊的策略和新的策略極有可能需要組合使用才能進行妥善的抗體驗證。
在圍繞抗體的所有這些問題面前，您如何選出合適的方法？
首先，您需要決定自己將在哪種檢驗測定中使用抗體。例如，CRISPR-Cas9方法不涉及目標蛋白的修飾，而且能夠驗證抗體缺乏與其他蛋白質的交叉反應。因此，您可以使用此項技術來為多種不同的檢驗測定進行抗體驗證，包括蛋白質印跡、IHC、免疫細胞化學（ICC）、流式細胞計、ELISA、免疫沉淀反應（IP）、染色質免疫沉淀反應（ChIP）以及反相蛋白測定等。2但由于修飾蛋白質的表達存在難度，因此僅建議對蛋白質印跡、IHC、ICC和流式細胞計使用標記蛋白質表達法來進行抗體驗證。
其次，研究人員必須清楚了解這些驗證方法的樣品限制。例如，CRISPR-Cas9/KO和標記蛋白質表達法都不能用于驗證人體組織樣品和體液（如血漿和血清）中的抗體。2這是因為，與細胞系不同，您無法在人體內進行遺傳基因操縱。
最后，無論抗體提供商使用了哪種抗體及其對應的驗證方法，研究人員都必須在具體的應用或樣品背景下執行至少一種驗證策略。2
針對特定應用和物種驗證每種抗體是獲得可重復和可靠結果的關鍵。本文信息將指導您就實驗室所采用的合適方法做出決策。在抗體驗證或其他應用方面如需進一步的協助，敬請訪問金斯瑞抗體技術資源。
改編自BitesizeBio代表金斯瑞編制的文章內容。
Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 2010.
Uhlen M, et al. A proposal for validation of antibodies. Nat Methods. 2016.
Bradbury A., et al. Standardize antibodies used in research. Nature. 2015.
