引物設計的下列原則供您參考：
常用的軟件有Oligo 6和Primer Premier 5.0。引物設計軟件是根據引物設計的指導意見設計而成。其實，PCR擴增的成敗最關鍵的是反應模板的制備和反應條件的控制。引物設計軟件的缺點是，有時判斷為該基因沒有一段區域滿足標準引物的要求。
金斯瑞為您提供以下引物設計相關軟件：
通常國外的文獻可信度比較高，可直接使用；但為了保險起見，推薦用blast對引物探針的序列進行必要的驗證；或者再進一步用引物設計軟件對引物探針的二級結構和退火溫度進行分析，這樣更有利于您對整個實驗的把握。
Tm值的概念：
DNA熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結構降解一半時的溫度，亦即DNA變性過程中，紫外吸收值達到最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度（Tm）。
金斯瑞采用以下方法計算Tm值：
長度為20mer及以下的引物，Tm計算公式為：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)。但這個公式只適用于14~20個堿基的引物，引物的TM值還與引物長度、堿基組成、引物使用緩沖溶液的離子強度等有關。
對于更長的寡聚核苷酸，Tm計算公式為：Tm=0.41(% of GC)–675/L+81.5
注：L：引物堿基數；% of GC：引物GC含量；% of GC=GC個數/引物總堿基數
| 修飾 | 說明 |
|---|---|
磷酸化（Phosphorylation） |
5'磷酸化可用于接頭、克隆和基因構建以及連接酶催化的連接反應。3'磷酸化可抗3'外切酶消化的相關實驗中，也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA鏈延伸反應。 |
生物素（Biotin） |
引物生物素標記，可用于非放射性免疫分析來檢測蛋白質、胞內化學染色、細胞分離、核酸分離、雜交檢測特異性的DNA/RNA序列、離子通道構象變化等。 |
地高新（Digoxigenin） |
地高新經由一個11個原子的間臂連接到脲嘧啶的C5位置，雜交的地高新探針可以由抗地高新抗體來檢測。地高新標記的探針可用于各種雜交反應，如DNA-DNA雜交（Southern blotting）、DNA-RNA雜交（Northern blotting）、斑點雜交（Dot blotting）、克隆雜交、原位雜交以及酶聯免疫分析（ELISA）。 |
內部氨基修飾 |
主要用C6-dT aminolinker來加到胸腺嘧啶殘基上來進行內部修飾。修飾后氨基與主鏈相距10個原子距離，可用于進一步的標記和酶連接（如堿性磷酸酶），目前提供內部氨基修飾介導的dT-Dabcyl、dT-Biotin和dT-Digoxingenin 修飾。 |
5'氨基修飾 |
可用于制備功能化的寡核苷酸，廣泛應用在DNA芯片（DNA Microarray）和多重標記診斷系統。目前提供5'C6氨基修飾和5'C12氨基修飾兩種，前者可用于連接一些即便靠近寡核苷酸也不會影響其功能的化合物，后者用于親和純化基團的連接和一些熒光標記，尤其是當熒光可能會因標記太靠近DNA鏈而被淬滅時。 |
3'氨基修飾 |
目前提供3'C6氨基修飾。它可用于設計新的診斷探針和反義核苷酸，例如5'端可用高度敏感的32P或熒光素標記的同時3'可用氨基修飾以進行其他的連接。此外，3'修飾可以抑制3'外切酶酶解，從而可用于反義實驗。 |
巰基（Thiol） |
5'-巰基在很多方面與氨基修飾類似。巰基可用于加附各種修飾如熒光標記物和生物素。例如可以在碘乙酸和馬來酰亞胺衍生物存在下來制作巰基連接的熒光探針。5'的巰基修飾主要用5'巰基修飾單體（5'-Thiol-Modifier C6-CE Phosphoramidite或Thiol-Modifier C6 S-S CE Phosphoramidite）。用5'-Thiol-Modifier C6-CE單體修飾后必須進行硝酸銀氧化以去除保護基（trityl），而Thiol-Modifier C6 S-S CE單體修飾后須用DTT將二硫鍵還原成巰基。 |
間臂（Spacer） |
Spacer可為寡核苷酸標記提供必要的間隔以減少標記基團與寡核苷酸間的相互作用，主要應用于DNA發夾結構和雙鏈結構研究。C3 spacer主要用于模仿核糖的3'和5'羥基間的三碳間隔，或“替代”一個序列中未知的堿基。3'-Spacer C3用于引進一個3'間臂從而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶發揮作用。Spacer 18常用于引進一個強親水基團。 |
硫代（Phosphorthioate） |
硫代修飾的寡核苷酸主要用于反義實驗中防止被核酸酶降解。您可以選擇全硫代，但隨著硫代堿基的增加，寡核苷酸的Tm值會降低，為了降低這種這種影響，可以對引物兩端2-5個堿基進行硫代修飾，通常可以選擇5'和3'各3個堿基進行硫代修飾。 |
脫氧脲嘧啶（DeoxyUridine，dU） |
脫氧脲嘧啶可以插進寡核苷酸來增加雙鏈的熔點溫度從而增長雙鏈的穩定性。每個脫氧胸腺嘧啶被脫氧脲嘧啶替代可以增長雙鏈熔點溫度1.7℃。 |
脫氧次黃嘌呤（deoxyInosine，dI） |
脫氧次黃嘌呤是一個自然存在的堿基，雖然不是真正意義上的通用堿基，但當與其它堿基結合時，會比其它堿基錯配相對更穩定。脫氧次黃嘌呤與其它堿基的結合能力為dI:dC>dI:dA>dI:dG>dI:dT.在DNA聚合酶的催化下，脫氧次黃嘌呤優先與dC結合。 |
主要因為是修飾單體穩定性較差，偶聯時間長，效率低，最后得到的產量自然低于一般的引物。修飾引物通常需要PAGE或HPLC純化，純化過程損失大。修飾引物使用的原料是一般引物原料的幾百倍，所以產品的價格自然高。
熒光探針保存方法如下：
熒光染料參數
| 縮寫 | 全名 | 吸收波長 | 發射波長 | 顏色 |
|---|---|---|---|---|
| 6-FAM | 6-carboxy-fluorescein | 494nm | 518nm | Green |
| TET | 5-tetrachloro-fluorescein | 521nm | 538nm | Orange |
| HEX | 5-hexachloro-fluorescein | 535nm | 553nm | Pink |
| TAMRA | tetramethyl-6-carboxyrhodamine | 560nm | 582nm | Rose |
| ROX | 6-carboxy-x-rhodamine | 587nm | 607nm | Red |
| Cy3 | Indodicarbocyanine | 552nm | 570nm | Red |
| Cy5 | Indodicarbocyanine | 643nm | 667nm | Violet |
5-FAM、6-FAM、FITC標記都是熒光素標記（Fluorescein），5-FAM與6-FAM互為異構體。它們的發色團均為熒光素，通常使用中沒有區別。
3'FAM-CPG原料的結構式
FITC原料結構式
FAM通過酰胺鍵與Oligo連接，而FITC通過硫脲鍵與Oligo連接，FITC上的-SCN與-NH2反應過程如下：
下圖是3'FITC和3'FAM與引物連接后的效果圖，5'FAM和5'FITC的連接方式與此相同。
由淬滅基團TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料組成的雙標記熒光探針常常被用作水解探針（Hydrolysis Probes），或稱TaqMan探針，用于實時熒光定量PCR實驗。
1）TAMRA為熒光染料，在淬滅報告基團的同時，會在更高波長處發射熒光。而Eclipse及BHQ系列為非熒光染料，淬滅報告基團時，自身不發射熒光，探針熒光本底比TAMRA低，檢測靈敏度更高。
2）TAMRA的吸收光譜覆蓋范圍窄，可與之匹配的報告基團種類比較少；而Eclipse則具有更寬的吸收范圍（390nm-625nm），可淬滅的報告基團種類很多，如FAM、HEX、TAMRA、ROX等均可；組合使用的BHQ系列染料的吸收光譜覆蓋范圍則更廣，從430nm一直到近紅外，可淬滅的報告基團種類更多，包括Cy3、Cy5等。因此可由Eclipse或BHQ系列染料組成一套雙標記熒光探針用于多重PCR。
下列原則可供您參考：
有些熒光基團在260nm處也有吸收光，例如FAM，HEX，TAMRA，TET。其它在260nm處可能也有吸收值，但是數據沒有公布，因此計算時不包括在里面。
5'磷酸化作用是通過B-氰乙基化學反應添加到引物5'端的糖環上，而不是最后一個堿基上；3'磷酸鹽被連接到固體支持介質上，所以在合成的第一個循環，堿基就與它偶聯。3'磷酸化修飾具有阻止聚合酶延伸的功能。
S-oligos是寡核苷酸中的單核苷酸之間的磷酸二酯鍵中的一個氧被硫代替后形成的。這種修飾是在連接的時候進行的（不是在合成后進行的）。堿基被添加上后，再進行連接修飾。在兩個堿基之間的磷酸可以轉換成雙鍵“S”（用硫代試劑）代替普通的雙鍵“0”（用碘溶液），和磷酸二酯鍵相連的堿基都可以進行這種修飾。
但3'末端堿基不能進行硫代磷酸化修飾，因為從固體支持物上解離下來時，磷酸酯鍵不存在了，3'末端堿基是OH。我們可以提供對S-oligo進行5'修飾，如客戶可以定制S-oligo的熒光素標記。S-oligo和普通的寡核苷酸在PAGE膠上的位置是一樣的。
5'Aminolinker(C6)是在合成循環的最后一步以亞磷酸胺的形式通過B-氰乙基化學反應添加到引物5'糖環上的，而不是添加到最后一個堿基上。
5'氨基標準的偶聯效率是>95%,氨基基團在260nm處是沒有吸光值的；它在210nm處有吸光值。不能通過電泳檢測它的存在（瓊脂糖或丙烯酰胺）。
3'Aminolinker(C7)只與一些5'修飾兼容，如FAM, HEX, TET, Fluorescein, Biotin, Amine, and phosphate。其它的5'修飾(如Alexa dyes)需要氨基才能與寡核苷酸相連，這就無法避免該染料與3'氨基相連。
氨基修飾是很簡單便宜的方法。任意一種氨基修飾都可以。5'末端C6類型效果很好。
HEX
HEX
HEX
FAM, HEX and TET是在合成循環結束時以亞磷酸胺的形式通過B-氰乙基化學作用添加上的，因此是添加到引物的5'末端的糖上而非引物的末端堿基。它們通過磷酸二酯鍵共價連接到5'端最末的糖環上。
在液體中的顏色：HEX是粉紅色，FAM是黃色，TET是橙色
經過這些修飾的寡核苷酸不能進行硫代磷酸化修飾。
| MW | Emission（nm） | Excitation（Abs）Max（nm） | Extinction（at max） | Extinction（at 260） | |
|---|---|---|---|---|---|
| FAM | 554.5 | 517 | 494 | 74,850 | 20,960 |
| TET | 692.2 | 538 | 522 | 85,553 | 16,255 |
| HEX | 761.1 | 553 | 535 | 95,698 | 31,580 |
注：摩爾消光系數是在最大nm處的激發光下測得的。因為pH或成分的微小變化可能會影響以上的數據。
