1. 如何確定需要合成多少nmol值的引物？

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定。以20個(gè)堿基左右引物為例：常規(guī)PCR擴(kuò)增，可選擇5nmol（約合1OD），可做200次50μl標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)；基因拼接或退火后做連接，可選擇5nmol（約合1OD）。

2. 如何測(cè)定引物的OD值？

合成引物的OD值是這樣測(cè)定的：用紫外分光光度計(jì)，波長260nm，石英比色杯，光程為1厘米，測(cè)定溶液的光密度。測(cè)定時(shí)溶液的光密度盡量稀釋到0.2-0.8之間。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，用1ml水稀釋測(cè)OD值。需要根據(jù)稀釋倍數(shù)換算出母液的OD值。例如，驗(yàn)證2OD引物量是否準(zhǔn)確，簡單的做法是：加入1ml水，徹底溶解混勻后，取100μl, 加入900μl水，用光徑為1cm的石英比色杯，波長260nm，此時(shí)光吸收的讀數(shù)為0.2。

3. 如何通過OD值計(jì)算引物的濃度？

金斯瑞的合成報(bào)告單和引物標(biāo)簽上都會(huì)標(biāo)識(shí)OD值與摩爾量。引物保存在高濃度的狀況下比較穩(wěn)定。溶解前您需要核對(duì)合成報(bào)告單和引物標(biāo)簽上的引物OD值是否一致。如果不一致，請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系。我們可以根據(jù)生產(chǎn)記錄查到實(shí)際產(chǎn)量是多少。

根據(jù)國際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)：1OD引物干粉約為33微克；引物的摩爾數(shù)（μmol）=質(zhì)量數(shù)/引物分子量=(OD數(shù)×33)/引物分子量

如您拿到1管2OD的引物，分子量是6565.3，引物的摩爾數(shù)（μmol）=(2×33)/6565.3≈0.010μmol=10nmol

若您需要溶解為10μM（=10pmol/μl）的溶液，只需加入1ml無菌ddH₂O或10mM pH7.5 TE緩沖液充分溶解即可。

4. 引物（含修飾）的分子量是如何確定的？

金斯瑞所提供的Oligo分子量均按照準(zhǔn)確算法進(jìn)行計(jì)算。

分子量計(jì)算公式：MW=A×313.21+G×329.21+C×289.18+T×304.2+M×301.2+R×321.21+W×308.71+S×309.2+Y×296.69+K×316.71+V×310.53+H×302.2+D×315.54+B×307.53+N×308.95+16×Ns+修飾基團(tuán)分子量-61.96

公式中Ns為硫代數(shù)目，硫代每個(gè)位置增加分子量16，其余字母均代表相應(yīng)堿基的個(gè)數(shù)。兼并堿基分子量取相應(yīng)堿基分子量的平均值，如M=A/C=(313.21+289.18)/2常用的兼并堿基代碼：M=A/C R=A/G W=A/T S=G/C Y=C/T K=G/T V=A/G/C H=A/C/T D=A/G/T B=G/C/T N=A/G/C/T

表3. 常規(guī)修飾基團(tuán)分子量

5. 如何保存引物？

引物合成后，經(jīng)過一系列處理和純化步驟，旋轉(zhuǎn)干燥而成片狀物質(zhì)。沒有溶解的引物非常穩(wěn)定，-20℃下可保存2-3年，甚至更長。溶解后的引物-20℃下避免反復(fù)凍融，可以保存至少半年以上。如果對(duì)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性要求較高，合成的OD值較大，建議將溶解好的引物事先稀釋為100μmol/L的儲(chǔ)存液，分裝數(shù)份保存于-20℃冰箱。使用前，將濃溶液稀釋成工作液（10pmol/μl或20pmol/μl）后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。修飾熒光引物需要避光保存。

6. 引物在常溫下運(yùn)輸，會(huì)降解嗎？

不會(huì)降解，干燥的引物在常溫至少可以穩(wěn)定存放二周以上。而一般的運(yùn)輸時(shí)間通常都在1-3天，所以您收到的引物不會(huì)降解。

7. 如何溶解引物？

干燥后的引物質(zhì)地非常疏松，開啟瓶蓋溶解之前推薦在3000-4000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心1分鐘，或管垂直向上在桌面上輕敲幾次，將引物粉末收集到管底，防止開蓋時(shí)引物散失。根據(jù)計(jì)算出的體積加入去離子無菌水或10mM Tris pH7.5緩沖液，室溫放置幾分鐘，上下混勻振蕩，離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因?yàn)橛行┱麴s水的pH值比較低（pH4-5），引物在這種條件下不穩(wěn)定。

我們的合成報(bào)告單給出了每管引物稀釋為100μmol/L（即100pmol/μl）濃度的加水量，您可以根椐您的實(shí)驗(yàn)需要加入適量的無核酸酶的雙蒸水（PH>6.0）或TE緩沖液（PH7.5-8.0）。

8. 已經(jīng)溶解的引物，為什么原先使用正常，而過一段時(shí)間再使用就不好了？

如果您溶解引物的水PH過低或污染了菌或核酸酶，會(huì)使引物降解。使用時(shí)沒有充分解凍混合，液體不均勻也可能會(huì)造成引物加入量不準(zhǔn)確。建議分裝引物，避免反復(fù)凍融，并使用10mM Tris pH7.5緩沖液溶解引物。還有一種可能性是引物沒有問題，而是PCR使用材料特別是模板的質(zhì)量與先前使用的不完全一致。

9. 如何檢測(cè)引物的純度？

實(shí)驗(yàn)室常見方法是用PAGE法。使用加有7M尿素的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，堿基數(shù)小于12個(gè)的引物用20%的膠，12-60個(gè)堿基的引物用16%的膠，大于60個(gè)堿基的引物用12%的膠。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性（95℃，2 min）。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進(jìn)行電泳，一定時(shí)間后（約2-3小時(shí)），剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測(cè)帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。（有時(shí)由于變性不充分，主帶之上可能會(huì)有條帶，乃是引物二級(jí)結(jié)構(gòu)條帶。）

另外純度檢測(cè)設(shè)備可以更加準(zhǔn)確的確定引物純度：

• HPLC（高效液相色譜）：根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來進(jìn)行梯度洗脫分離。其作用機(jī)制是：當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱時(shí)，溶質(zhì)分子 和溶劑分子對(duì)吸附劑表面活性中心發(fā)生競爭吸附。（目前主要用的是反相柱）；
• CGE（毛細(xì)管電泳儀）：以高壓電場為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)，達(dá)到純度分析的效果。金斯瑞已經(jīng)將其作為引物質(zhì)量控制的重要手段之。

10. 當(dāng)引物的OD₂₆₀/OD₂₈₀小于1.8時(shí)，引物的純度合格嗎？

OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值不能用來衡量引物的純度。OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值過低一般是由于引物中C/T的含量比較高所致。下表是一個(gè)20 mer 同聚體引物的OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值，清楚表明OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值與引物的堿基組成密切相關(guān)。

11. 同樣的OD用PAGE檢測(cè)，EB染色為什么深淺不一？

通常可以用EB染色的方法來判斷雙鏈DNA的量（如質(zhì)粒DNA），因?yàn)镋B是通過嵌入到核酸的雙螺旋間而使其著色的。而合成的單鏈DNA，只有通過自身回折形成局部發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)或鏈間形成部分雙螺旋結(jié)構(gòu),才能被EB染色。由于堿基組成不同，不同引物形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性不同，EB的染色程度也會(huì)有差異，比如Oligo（dT）等不形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，EB染色效果就非常差。因此不能用EB染色的方法來進(jìn)行定量，而應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。

12. 進(jìn)行PAGE電泳時(shí)，長度完全一樣的Oligo DNA為什么泳帶不在同一位置？

這種情況在Oligo DNA越短時(shí)越容易發(fā)生，長鏈Oligo DNA之間差別較小。主要有兩個(gè)原因：

RT-PCR。很多基因通過常
• A、G、C、T的組份不同，電泳速度不同；
• DNA的立體結(jié)構(gòu)不同，電泳速度不同。

13. 能否使用Agarose凝膠電泳分析合成的引物？

對(duì)引物進(jìn)行電泳一定要使用變性PAGE電泳。由于引物是單鏈DNA，容易形成復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)，因此進(jìn)行Agarose電泳時(shí)，容易出現(xiàn)多條泳帶或無條帶的現(xiàn)象，更無法用Agarose電泳進(jìn)行定量了。

14. 有時(shí)候干燥后的引物呈黃褐色，這是DNA的本身顏色嗎？

合成的引物可能呈黃褐色，白色或者透明色，這與引物的堿基組成和合成的制備過程有關(guān)，序列中A和G含量多的以及OD值大的引物通常呈黃褐色，所以呈黃褐色的引物不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生任何影響。

15. PCR擴(kuò)增不出來，跟引物有關(guān)嗎？

基本上不是。當(dāng)今發(fā)展出各色各樣的PCR擴(kuò)增技術(shù)，各色各樣的高溫聚合酶，就是來解決PCR擴(kuò)增中遇到的擴(kuò)不出，擴(kuò)增效率低的問題。如槽式PCR就是擴(kuò)增那些拷貝數(shù)很低的基因片段。有些重復(fù)片段、GC含量高的片段擴(kuò)增，必須采用特殊擴(kuò)增手段才能擴(kuò)增出來。

擴(kuò)增不出，主要是下列兩種情況比較常見：

• RT-PCR。很多基因通過常規(guī)RT-PCR方法是很難擴(kuò)增出來的。RT-PCR成功的關(guān)鍵在于RT反應(yīng)的RNA質(zhì)量和目標(biāo)基因在特定組織和細(xì)胞中的含量。
• 從基因組中擴(kuò)增。一般情況下，基因在基因組中都是單拷貝，基因組作為模板需要嚴(yán)格控制用量。基因組DNA過高，會(huì)影響反應(yīng)體系中的Mg²⁺濃度和pH。

如果排除其它原因認(rèn)為是引物問題，可以向我們反饋具體情況，我們會(huì)在檢測(cè)之后給予您很好的解決方案。

16. 合成的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)無目的帶，怎么辦？

PCR反應(yīng)失敗的原因很多，可以從以下幾個(gè)方面考慮：

• 引物和模板是否配對(duì)，同源性有多大？
• 引物本身是否有立體結(jié)構(gòu)，或者二條引物之間是否形成高次結(jié)構(gòu)？
• PCR反應(yīng)用試劑是否能正常工作？
• PCR儀是否工作正常？
• PCR反應(yīng)條件是否合適？

如果一切正常，還無法解決問題時(shí)，我們可以免費(fèi)重新合成引物一次。

17. PCR擴(kuò)增有很強(qiáng)的非特異條帶，說明引物有污染嗎？

不能。我們?cè)治鲞^一些非特異條帶，測(cè)序發(fā)現(xiàn)在這些非特異性片段的兩頭至少可以發(fā)現(xiàn)一條引物序列。因此非特異性擴(kuò)增一般是模板污染（如RNA中污染基因組）或擴(kuò)增條件不合適所致。

18. 如何將兩條互補(bǔ)的單鏈退火形成雙鏈？

用退火緩沖液（10mM Tris，pH7.5-8.0，50mM NaCl，1mM EDTA）溶解引物，將要退火的引物等摩爾數(shù)混合，總體積不要超過500μl，加熱到95℃，2min，然后緩慢冷卻至室溫（低于30℃）即可。退火的產(chǎn)物可以放在4℃待用。

19. 引物片段退火后不能連接到載體上是什么問題？

連接反應(yīng)的引物如果沒有5'磷酸基團(tuán)，連接效率相對(duì)較低，但不是完全不能成功。如果磷酸化的產(chǎn)物還不能連接載體上，需要檢查載體的酶切效果以及核對(duì)引物的設(shè)計(jì)方案，如果都沒有問題就要考慮改善引物退火的條件以及連接反應(yīng)體系。

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