1. 引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。該方法具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。主要是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成，由待合成引物的3'端向5'端合成延伸，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。

固相亞磷酰胺三酯法合成引物的具體步驟如下：

• 用三氯乙酸去除固相載體5'-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5'-羥基；
• 將亞磷酰胺保護核苷酸單體與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，與游離的5'-羥基發生縮合反應；
• 由于無法保證百分之百的5'-羥基都參與縮合，可能有極少數5'-羥基沒有參加反應（少于2%），可用乙酸酐和1-甲基咪唑試劑將其終止合成，這種短片段可以在純化時分離掉；
• 在氧化劑的作用下，亞磷酰形式轉變為更穩定的磷酸三酯，使DNA磷酸骨架更穩定。

經過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸就被連接到固相載體上。重復以上步驟，直到所有要求合成的堿基連接完成。合成過程中可以監控脫下的保護基團DMT的顏色可以初步判定合成效率。

2. DNA合成粗產物中含有什么雜質？

主要是合成過程中產生的少量失敗片段。

3. 引物純化方式有哪些？

目前引物常用的純化方式有：C18脫鹽、RPC純化、ePAGE純化、PAGE純化、HPLC純化。

表1. 引物純化主要方式的介紹

4. 引物純化方式如何選擇？

金斯瑞采用RPC、ePAGE純化、PAGE、HPLC四種純化方式，在選擇上主要根據引物的長度和應用方面對純度的要求而定，表2即從引物長度的角度總結了以上每一種純化方法的適用范圍。您可根據實驗需要，選擇合適的引物純化方式。如您需要進一步的指導，請聯系金斯瑞技術支持。

表2. 引物純化主要方式的適用范圍及建議

注：*為了保證您的引物純度，對于<5mer的短鏈引物選擇RPC純化前請先致電咨詢

5. 合成的引物5'端是否有磷酸化？

合成的引物5'端為羥基，沒有磷酸基團。如果需要，您可以用多核苷酸激酶進行5'端磷酸化，或者要求我們合成時直接在5'或3'端進行磷酸化，需要另外收費。

6. 最長可以合成多長的引物？

引物越長，出現問題的概率就越大。除非有特殊需要，我們建議合成片段長度不要超過80mer，按照目前的引物合成效率，80mer的粗產品，全長引物的百分比不會超過40%，后續處理還會丟失很多，因此最后的產量很低。金斯瑞可合成長達150base的引物。

7. 為何長鏈引物的收費要比短鏈引物要高？

在合成長鏈引物時，所需要的試劑比短鏈引物要多，回收值也相對低一些，尤其是長度大于90base的引物。由于成本的增加，從而導致價格升高。

8. 交付引物質量好壞的判斷標準是什么？

合成的引物和您的訂單序列一致，通過完善的訂單訂購系統，全自動序列導入系統以及嚴格的質量控制體系，確保合成序列準確無誤。

9. PCR產物經過克隆以后測序發現引物區與合成序列不相符合，怎么辦？

多數情況是PCR過程和克隆過程中引入的錯誤。遇到這種情況，請您

• 重新挑取克隆測序，會有找到正確克隆的可能。
• 可以要求我們重新免費合成引物。

10. 測序發現引物有突變是怎么回事？

引物合成是一種多步驟的化學反應，每一步的合成效率最高也就是99%，副產品不可以避免。鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。在您PCR擴增后克隆測序的時候，為了節約時間和提高成功率，我們有如下建議：

• 請您在檢測到陽性克隆后準備2~3個陽性克隆子的菌液，盡量送測2個或以上克隆，這樣成功率將大大提高，也節約很多時間；
• 也可以先送測1個克隆，其余兩個克隆子的菌液在冰箱4度保存，一旦出現個別點突變或缺失，立即將余下的兩個克隆送測；
• 這樣得到正確的序列可能性將非常高，并且可以免去重新PCR、連接、克隆以及篩選的一系列實驗操作，更省去了很多時間；

如您發現2~3個以上克隆都在引物區存在突變，經確認是由引物的原因引起的話，我們將會立即安排加急免費重合，并以足夠快的速度送到您的手里。

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