行業洞見
細胞治療 & CAR T療法定義
- 細胞治療：利用患者自體（或異體）的成體細胞（或干細胞）對組織、器官進行修復的治療方法，用于骨髓移植、晚期肝硬化、股骨頭壞死、惡性腫瘤等疾病。其中，以CAR T為代表的細胞治療在血液腫瘤治療領域中取得了備受矚目的優異療效。
- CAR T療法：通過基因工程技術，在激活的T細胞上安裝定位導航裝置CAR（腫瘤嵌合抗原受體），特異識別體內腫瘤細胞，并通過免疫作用釋放大量的多種效應因子，高效地殺滅腫瘤細胞。
CAR T療法上市產品與適應癥
- FDA已批準6款CAR T上市藥物：
- Kymriah-諾華：B細胞急性淋巴細胞白血病、彌漫性大B細胞淋巴瘤
- Yescarta-吉列德/Kite：大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤
- Tecartus-吉列德/Kite：套細胞淋巴瘤
- Breyanzi-百時美：彌漫大B細胞淋巴瘤
- Abecama-百時美/藍鳥：多發性骨髓瘤
- 西達基奧侖賽-傳奇生物：復發/難治性多發性骨髓瘤
- 中國國家藥監局已批準2款CAR T上市藥物：
- 益基利侖賽注射液-復星凱特：難治性大B細胞淋巴瘤
- 瑞基奧侖賽注射液-藥明巨諾：大B細胞淋巴瘤
另外，全球還有6款藥物已注冊，市場未來5-6年內預計市場上會出現約12款CAR T藥物。
CAR T療法開發路線與重點
- CAR T 開發路線
- CAR T 開發重點
- 高效的CAR結構：針對腫瘤細胞的特異性高，避免脫靶毒性導致嚴重的毒副作用
- 合理的共刺激結構域：提高T細胞增殖活性、腫瘤細胞殺傷力，延長T細胞存活時間
- 精準的遞送方案：準確高效的將CAR序列整合至T細胞、規避脫靶
CAR T療法新突破方向
- 攻克實體瘤領域應用的瓶頸
- 探索放大規模、降低成本的工藝
- 提升CAR T細胞體內的持續性
- 降低細胞因子風暴的副作用
- 開發通用型CAR T、CAR NK細胞、雙靶點CAR結構域、與免疫抑制劑等聯用增效
CAR T療法研發流程
CAR候選分子發現
CAR T免疫治療通過CAR識別腫瘤細胞，并釋放細胞因子，發揮抗腫瘤作用。CAR主要由胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域組成。胞外結構域中的單克隆抗體的單鏈可變片段（scFv）可決定抗原的特異性和親和力，跨膜結構域可影響CAR在細胞表面表達，胞內結構域中共刺激域與信號轉導結構域則起到信號活化轉導使T細胞發揮殺傷力的作用。其中，特異性好、親和力高的抗體制備工藝，將有助于篩選到副作用小、殺傷作用強的CAR序列。
關鍵點：如何構建特異性好的抗原識別結構域（scFv）？
方案：抗體篩選流程與金斯瑞解決方案
金斯瑞優勢：
- 抗原制備平臺：專利設計軟件、難度項目交付能力、高標準質量
- 鼠/兔快速免疫平臺：獨特的抗原修飾技術，打破免疫耐受
- B細胞克隆平臺：快速免疫、高親和力、高多樣性
- 重組抗體表達平臺：表達量高、一致性好、嚴控內毒
- ScFv優化平臺：精準突變文庫更經濟、5-10倍親和力提升、避免人抗鼠抗體反應
金斯瑞案例：
金斯瑞MonoRab?兔單克隆抗體親和力高
（Biacore檢測抗原-抗體親和力）
金斯瑞MonoRab?兔單克隆抗體多樣性好
（表位歸類）
實驗結果：表位歸類結果表明16個克隆分屬于11個不同的表位，表明金斯瑞MonoRab?兔單克隆抗體多樣性好。其中2F8抗體KD可達10-12M，表明其親和力高。
*金斯瑞可交付KD數值高達10-10M水平的鼠單克隆抗體，親和力高、多樣性好，易于后續人源化開展。
CAR T細胞構建
在將CAR序列整合至T細胞的過程中，利用病毒遞送基因，存在CAR序列會隨機插入細胞基因組任意位置的風險。可能干擾整個基因組功能、影響隨機插入位點附近的功能基因表達。
CRISPR基因編輯技術具有優越的靈活性與編輯效率，較之慢病毒轉染遞送序列的方案，CRISPR不僅可以更安全的實現在特定位點插入CAR序列，還可以敲除PD1、TRAC、TRBC等多個基因，同時工藝更簡單經濟。目前，“CAR T之父”Carl H. June教授在內的一些團隊已經在臨床試驗中獲得了部分基于CRISPR技術制備的CAR T細胞安全有效的證據。這些優勢使得CRISPR技術在下一代CAR T細胞制備工藝中展現出巨大潛能。編輯效率高、脫靶效應低、細胞毒性低的CRISPR試劑將使該技術路線如虎添翼。
關鍵點：如何高效精準的將CAR整合至T細胞基因組？
方案：CRISPR技術編輯T細胞流程與金斯瑞解決方案
(點擊服務名稱了解詳情)
Tips：基于CRISPR技術的CAR序列整合方案的優勢
- 更安全！可將CAR序列插入到特定的位點，例如T細胞受體位點（TRAC）、任何基因組上的安全港位點
- 更高效！可敲除T細胞天然受體和PD-1免疫檢查點，增強T細胞活性和持久性
- 更簡單！實驗操作簡單，更易于后續GMP工藝開發與成本優化
金斯瑞優勢：支持科研至IND申報需求
- EasyEdit sgRNA：篩選階段-細胞毒性低、編輯效率高、更穩定、更快更經濟、即買即用
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SafeEdit sgRNA：驗證階段-細胞毒性低、編輯效率高、更穩定、HPLC純化、定制化QC
- GenExact™ ssDNA：長單鏈DNA，細胞毒性低、脫靶效應低、敲入效率高，提供科研至臨床前研究級
- GenWand™ dsDNA：雙端共價封閉雙鏈DNA，2-10 kb長基因敲入、μg-g交付量、敲入效率高，提供科研至臨床前研究級
- iGUIDE脫靶分析：根據細胞內真實脫靶情況檢測更準確，依托NGS平臺靈敏度高，基于金斯瑞優化的dsODN tag，降低假陽性
金斯瑞案例：
金斯瑞EasyEdit sgRNA編輯效率高 (VS IVT sgRNA)
金斯瑞-GenExact™ ssDNA敲入效率高
合作伙伴
- 提供匹配臨床研究與申報要求的基因編輯關鍵原料sgRNA
- 擬合作制定基因細胞治療領域關鍵原材料行業標準
戰略合作！金斯瑞Basic GMP sgRNA支持北恒生物通用型CAR T申報
- 較之實驗室合成的HDR模板，細胞毒性低、敲入效率高
- GMP適用規模的GenExact? ssDNA制備的BCMA-CAR細胞可達到患者使用劑量（1.5 x 109）、并表現出腫瘤殺傷活性
CAR敲入效率46.2%！金斯瑞GenExact? ssDNA支持BCMA-CAR臨床試驗
CAR T功能驗證
構建完成的CAR T細胞即可進入功能驗證環節，例如通過CAR表達量檢測確認效應CAR T細胞制備效果、通過腫瘤細胞殺傷實驗檢測CAR T細胞體外藥效、通過模式動物評估CAR T細胞體內安全性與藥效、通過監控體內CAR T細胞含量變化考察藥代藥動信息等等，這些都將為CAR T細胞的成藥性提供重要依據。金斯瑞細胞系構建服務可以提供檢測模型、抗獨特型抗體服務可以提供檢測試劑，支持功能驗證階段的不同CAR T細胞的定制化需求。
關鍵點：如何評價CAR T細胞對腫瘤殺傷活性？
方案：構建細胞系驗證CAR表達/CAR T對腫瘤細胞殺傷活性
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金斯瑞優勢：2,000+穩定細胞系交付經驗，400+抗獨特型抗體項目交付經驗
- 細胞系構建平臺：嚴格的合規性 ( ISO 9001: 2015、BSL2實驗室 )、清晰的細胞/質粒IP與實驗記錄、高標準QC（180種常見支原體檢測）
- 抗獨特型抗體平臺：從抗獨特型抗體發現到PK和ADA試劑盒開發與生產、保證交付即用PK和ADA檢測試劑盒、可合規用于臨床樣品檢測
金斯瑞案例：
構建表達細胞系-通過FASC檢測熒光值檢測不同CAR序列表達量
構建效應/靶細胞系-檢測不同CAR序列的CAR T細胞對腫瘤細胞殺傷活性
結論：CAR1序列表達量更高、殺傷效果更優好，可作為候選序列開展后續開發工作
CAR NK/CAR M新方向
CAR T細胞在臨床抗腫瘤、尤其是血液腫瘤領已經取得了豐碩成果，然而現階段仍存在抗實體瘤的局限、細胞因子風暴等副作用、制備周期和費用成本較高等問題，也催生了以CAR NK、CAR 巨噬細胞等新方向的研究快速發展，這些新方向又有什么與眾不同的特點呢？
CAR NK
NK細胞通過慢病毒轉染或基因編輯添加CAR結構后，同樣能夠特異識別腫瘤細胞，通過釋放殺傷介質、誘導靶細胞凋亡等途徑殺傷腫瘤細胞。FDA已批準臨床多個CAR NK在血液腫瘤與實體瘤中臨床研究，CDE也于2021年11月批準首個“現貨型”異體來源的CAR-NK產品的臨床試驗申請，用于治療晚期上皮性卵巢癌。
CAR NK的特點：
- 來源廣泛：可來源于外周血、臍帶血、 誘導多能干細胞（iPSC）、NK細胞系。其中，iPSC來源具有供體細胞需求量少，成本低，可無限培養，免疫原性較低等優點。
- 安全性高：NK細胞分泌IL-3和GM-CSF等，造成細胞因子風暴的可能性較小。NK細胞存活時間更短、產生未知副作用的風險小。
- 快速高效：不受MHC識別的限制，可通過天然受體識別和靶向腫瘤細胞，快速殺傷腫瘤細胞，降低腫瘤細胞逃脫的可能性，有效殺傷長期治療后可能改變表型的殘留腫瘤細胞。
- 現貨性產品：異體NK細胞移植幾乎不會誘發移植物抗宿主?。℅VHD），分泌PD-1的水平較低，具有開發“現貨型”產品的潛力。
CAR NK的挑戰：
- 增殖潛力有限：單個供體的NK細胞數量少，NK細胞細胞分裂次數有限，通常需要2-3周時間來培養NK細胞，難以擴增至輸注所需的大量細胞，可考慮通過iPSC里獲得更大量的NK細胞。
- CAR導入困難：病毒轉導NK細胞效率較差、同時可能引起隨機插入，mRNA/轉座子被認為是一種安全的轉染方法，CRISPR定點敲入CAR序列也是一個新思路。
- 相關服務： CRISPR/Cas9 sgRNA合成服務、 HDR基因敲入模板 、 質粒制備服務、 慢病毒包裝服務
- 持續性較短：NK細胞的存續時間有限，雖有助于它們的安全性，但也縮小了治療窗口。
- 凍融敏感：解凍后NK細胞的存活率和細胞毒性顯著降低，可能會影響其運輸、儲存和現貨性產品開發，需要探索對NK細胞影響較小的凍融步驟。
CAR 巨噬細胞
巨噬細胞是人體免疫中核心細胞之一，具有對體液和組織中的細胞殘片及病原體的吞噬及消化作用，并通過抗原呈遞功能激活淋巴球或其他免疫細胞，使其對病原體作出反應。添加CAR后的巨噬細胞能夠準確識別腫瘤細胞，進而吞噬腫瘤細胞，同時表達促炎細胞因子和趨化因子，將“旁觀者”M2型巨噬細胞轉化為M1型 。CAR-巨噬細胞還可以將癌細胞抗原碎片呈遞給T細胞，激活T細胞，并抵抗免疫抑制細胞因子的作用。
2021年9月23日，CARISMA Therapeutics宣布美國FDA已授予該公司靶向人表皮生長因子受體2 (HER2) 的嵌合抗原受體-巨噬細胞(CAR-M)療法CT-0508快速通道資格，用于治療實體瘤。
