引物純化及檢測

引物純化方式建議

金斯瑞擁有20多年經驗豐富的引物專家團隊及多臺國際先進的DNA合成儀，合成的引物純度高且反應不完全的短鏈少，應用于PCR擴增、DNA測序以及基因合成等的實驗，無需進一步純化。但未進一步純化的引物始終含有合成和脫保護不完全的產物、合成不正確的引物以及在合成后處理中從堿基上切割下來的保護基團，因而是否需要進一步純化取決于對副產物占最終產物大概比例的評估以及這些副產物對客戶后續實驗的影響程度。

通常而言，引物進一步純化主要起到三個方面的重要作用：1. 從最終產物（n mer）中去除反應不完整的短鏈引物（n-1 mer，n-2 mer等）；2. 去除引物合成反應中的副產物；3. 去除從堿基上切割下來的保護基團。引物純化方式有很多種，目前常見的幾種引物純化方式，如C18柱脫鹽、RPC純化、ePAGE純化、PAGE純化及HPLC純化等。表1即對以上幾種純化方式進行了一一介紹。

表1. 引物純化主要方式的介紹

純化方式	詳細說明
C18柱脫鹽	又稱為簡易反相柱，對DNA有特異性吸附，可被有機溶液洗脫，但不會被水洗脫，因此能有效地去除鹽分，但不能有效去除比目的片段短的小片段。該方法一般不會對普通PCR反應產生影響。對于需要用于測序、克隆的引物不能使用這個級別。
RPC純化	RPC純化是通過反相凈化濾芯（Reverse Phase Cartridge）對引物進行純化，純化原理與反相HPLC純化一樣。與反相HPLC比較，RPC是一種有效且更加經濟的純化方式。反相凈化濾芯通常包含一種疏水基質如C18的硅膠，能夠很好的吸附DNA，并且可以用水輕松地將切割下來的保護基團和短的引物片段從反相柱上洗掉。RPC純化的引物可以應用于DNA測序、PCR及基因合成等。
ePAGE純化	ePAGE是一種利用快速電泳對引物進行分離純化的方法，具有通量大，速度快的特點。依靠全自動進樣，快速電泳，自動純化等設備，短時間內完成DNA條帶的分離純化。純度可滿足大多分子生物學實驗需求，如質粒DNA測序、全基因合成、定點突變、PCR克隆等。
PAGE純化	PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對引物DNA進行分離，然后從凝膠中回收目的DNA。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的DNA純度大于90%，對長鏈Oligo DNA（大于50mer）的純化特別有效。
HPLC純化	HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對引物DNA進行純化。該方法用于分離純化或分析時能達到很高的純度和靈敏度。在引物DNA的分析和純化中，常用的有離子交換（ion-exchange）HPLC和反相（reverse-phase）HPLC。reverse phase HPLC：純度大于90%；ion exchange HPLC：純度大于95%，可以有效的去除N-1短片段。HPLC純化主要用于短鏈和修飾引物的純化。該法的缺點是成本較高，批量生產效率不高。

金斯瑞采用RPC、ePAGE、PAGE、HPLC幾種純化方式，在選擇上主要根據引物的長度和應用方面對純度的要求而定，表2即從引物長度的角度總結了以上每一種純化方法的適用范圍。您可根據實驗需要，選擇合適的引物純化方式。如您需要進一步的指導，請聯系金斯瑞技術支持。

表2. 引物純化主要方式的適用范圍及建議

純化方式		引物長度				建議	適用范圍
純化方式		<15mer	15～40mer	41～59mer	60～120mer	建議	適用范圍
RPC		適用^*	推薦	適用	不適用	快速、通量大，常用于PCR、測序引物等。	常用于PCR擴增、全基因合成及DNA測序等。
ePAGE		不適用	推薦	適用	不適用	純度可滿足大多分子生物學實驗需求。	常用于質粒DNA測序、全基因合成、定點突變（環狀突變）及PCR克隆等。
PAGE		不適用	適用	適用	推薦	常規分子生物學實驗引物采用RPC純化或ePAGE純化即可；但強烈建議長鏈引物（≥60mer）選用PAGE純化。	50mer以上的未修飾寡核苷酸，用于定點突變、克隆、蛋白結合凝膠遷移電泳分析、治療與診斷用途。
HPLC	離子交換	推薦	適用	適用	不適用	對純化短鏈引物（<15mer）特別有效，但此法純化通量小、成本較高。如實驗對純度要求非常高，建議選用HPLC與PAGE雙重精制。	小于50mer的未修飾寡核苷酸，用于定點突變、克隆、蛋白結合凝膠遷移電泳分析、治療用途；帶有疏水基團的修飾引物；商業化的診斷引物或探針（80%～95%純度）。
HPLC	反相	推薦	適用	不適用	不適用

注：*為了保證您的引物純度，對于<5mer的短鏈引物選擇RPC純化前請先致電咨詢

引物合成服務

引物檢測方式

高效液相色譜（HPLC）

HPLC是一種高效的分析寡核苷酸的方法。其中ion exchange HPLC的純化柱是以離子交換樹脂為填充料，可以非常有效的檢測出N-1或N-2短片段。

毛細管凝膠電泳（CGE）

CGE是一種將凝膠移到毛細管中作支持物進行的電泳，基于尺寸排阻機理，可實現單核苷酸分離，可用于測定寡核苷酸純度，分辨率高，定量準確。CGE-UV是寡核苷酸純度測定的非常有效方法，能夠在150mer的長度范圍內實現N-1分辨，檢測無需染色標記。

金斯瑞擁有高通量測定寡核苷酸純度分析系統，通過純度分析保證最終交付客戶的引物純度。

質譜分析（MS）

MS是用電場和磁場將運動的離子（帶電荷的原子、分子或分子碎片）按它們的質荷比分離后進行檢測的方法。質譜可以測定引物的分子量大小，從而有效的鑒定引物合成序列的準確性。

注：以上檢測需另行收費，您可根據實驗需要，自行選擇。

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