科研資訊分享 » 文獻(xiàn)解讀 » 引物池助力堿基編輯器, 讓遺傳變異的大規(guī)模功能表征更高效 - 金斯瑞
2月18日，博德研究所的Ruth E. Hanna等在Cell雜志上發(fā)表文章，報(bào)道了一種利用CRISPR-Cas9胞嘧啶堿基編輯器的基因池篩選方法，用于對(duì)人類單核苷酸變異的大規(guī)模并行性評(píng)估，其中，基于引物池合成的sgRNA文庫，為加速研究推波助瀾。該研究突破了罕見病研究和癌癥基因組學(xué)的變異表征瓶頸，對(duì)在臨床中表征未知功能變異具有深遠(yuǎn)意義。
單核苷酸變異篩選對(duì)于表征可能導(dǎo)致某些罕見疾病的突變至關(guān)重要。然而，目前的篩選方法還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能令人滿意。例如，飽和誘變（Saturation mutagenesis）只適用于產(chǎn)生小基因的單核苷酸變異，而利用Cas9介導(dǎo)同源重組修復(fù)（Homology directed repair，HDR）的飽和基因組編輯篩選（Saturation genome editing screens）又存在著在人體細(xì)胞中效率低下的問題。因此，RuthE. Hanna等意識(shí)到需要一種新的篩選方法來實(shí)現(xiàn)簡單、可預(yù)測(cè)和可度量的變體篩選。
本研究的圖解摘要 *圖片來自Cell雜志網(wǎng)站
Ruth E. Hanna等使用胞嘧啶堿基編輯器對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的遺傳變異進(jìn)行了混合篩選，以便對(duì)其進(jìn)行定量評(píng)估。
金斯瑞引物池技術(shù)，為該研究中sgRNA文庫提供了更節(jié)省時(shí)間與經(jīng)費(fèi)成本的高質(zhì)量建庫方案。
研究人員將化膿性鏈球菌sgRNA文庫克隆到慢病毒載體中，在黑色素瘤細(xì)胞系中，用陰性和陽性選擇試驗(yàn)篩選了該文庫。從陰性和陽性篩選得到的數(shù)據(jù)顯示，堿基編輯器篩選在兩種情況下都能有效識(shí)別引入功能喪失型突變的sgRNAs。然后，研究人員在另外4個(gè)細(xì)胞系中篩選相同的文庫，檢測(cè)細(xì)胞類型對(duì)靶向泛致死基因sgRNA表現(xiàn)的影響。結(jié)果顯示sgRNA在所有5種細(xì)胞類型中均有一致的表現(xiàn)。
通過對(duì)2種細(xì)胞系中的乳腺癌基因BRCA1和BRCA2進(jìn)行堿基編輯器篩選，研究人員以較高的準(zhǔn)確度鑒定了BRCA1和BRCA2中已知的功能喪失型突變。他們?cè)贑linVar中制定了一套黃金標(biāo)準(zhǔn)變體，注釋為致病/可能致病的(pathogenic/likely pathogenic, PLP)或良性/可能良性的(benign/likely benign, BLB)，并發(fā)現(xiàn)堿基編輯器篩選能很好地將PLP與BLB變體區(qū)分出來。
此外，研究人員探討了藥物-靶標(biāo)間的相互作用，以篩查引起敏感性或耐藥性變化的突變。他們?cè)谝粋€(gè)細(xì)胞系中篩選與MCL1（一種在癌癥中經(jīng)常上調(diào)表達(dá)的基因）相關(guān)的基因文庫，發(fā)現(xiàn)MCL1中的錯(cuò)義突變賦予了對(duì)BH3類似物的敏感性和抗性。同樣，他們?cè)O(shè)計(jì)并篩選了一個(gè)PARP1基因相關(guān)的文庫。PARP1是重要的腫瘤學(xué)靶標(biāo)，原因是它在BRCA1和其他DNA損傷基因的功能喪失型突變的腫瘤中具有合成致死性。研究人員在具有5種臨床PARP抑制劑的細(xì)胞系中篩選該文庫，結(jié)果表明，堿基編輯器技術(shù)能夠有效地進(jìn)行陰性選擇篩選，從而識(shí)別那些能增加細(xì)胞對(duì)藥物治療敏感性的突變。他們還創(chuàng)建了一個(gè)預(yù)計(jì)能夠在3584個(gè)基因上產(chǎn)生52,034個(gè)臨床變異的sgRNA文庫，并在存在細(xì)胞應(yīng)激因子的情況下對(duì)該文庫進(jìn)行了篩選，從而鑒定了許多DNA損傷修復(fù)基因中的功能喪失型變異。通過這一系列的實(shí)驗(yàn)研究，該研究小組得出結(jié)論，堿基編輯器可用于引入和在聚合篩選中評(píng)估數(shù)以萬計(jì)的遺傳變異。這是一種靈活的、可擴(kuò)展的、能夠?qū)ψ儺愡M(jìn)行功能分析的篩選方法。
本研究中使用的引物池由金斯瑞合成。引物池合成服務(wù)一次性合成多達(dá)91,766條引物，序列覆蓋率99%以上，堿基單價(jià)低至1分錢，讓您不再為預(yù)算和周期而煩惱，專心進(jìn)行合成生物學(xué)研究、靶向測(cè)序及復(fù)合DNA文庫實(shí)驗(yàn)等，將您的所有科研設(shè)想變成現(xiàn)實(shí)。
