糾錯DNA，科幻走進現實——堿基編輯系列專題 Vol.1

David R. Liu

堿基編輯技術的出現，使得科幻小說中的構想有望成為令人激動的現實，未來我們能夠給予孩子的最重要的禮物，可能不僅僅是30億個DNA字母，還有保護和修復它們的方法。

人類單倍體基因組含有約31.6億個DNA堿基對，堿基對是以氫鍵相結合的兩個含氮堿基，以胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）和鳥嘌呤（G）四種堿基排列成堿基序列，其中A與T之間有兩個氫鍵配對，G與C之間有三個氫鍵配對。堿基的點突變是引發人類遺傳病的主要原因之一，據ClinVar database顯示，由C?G到T?A的突變，約占已知人類致病單核苷酸突變的一半。如果可以在基因組DNA中將目標A?T堿基對轉化為G?C堿基對，將有可能糾正大部分與人類疾病相關的SNP。^{[1, 4]}

圖1：引發人類遺傳病的單堿基突變

近年來CRISPR技術（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）被廣泛應用于各種生物的基因組編輯。然而，如果將CRISPR技術用于基因治療或生物定向改造，需要對突變位點的精準識別，不能出現意外的隨機插入或者缺失。美國哈佛大學David R. Liu課題組發表在《Nature》的” Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage”論文創新性的開發了基于CRISPR/Cas9的單堿基編輯器（base editor, BE），有望為上述問題提供新的思路。

相比傳統的CRISPR/Cas9系統，單堿基基因編輯技術具有以下優勢^[2]：

• 編輯效率高 傳統的CRISPR/Cas9系統對細胞的編輯效率僅為0.1%- 5%；而單堿基編輯技術對細胞的編輯效率高達70%-80%。
• 插入缺失突變率低
• 脫靶率低

一探究竟，“神器”如何實現堿基編輯

單堿基編輯器可以將單核苷酸突變（SNV）引入活細胞的DNA或者RNA中，是基因組編輯領域的最新進展之一。 單堿基編輯器可以分為兩大類：針對DNA的和針對RNA的。科學家們不斷的改造和優化單堿基編輯器，使得DNA和RNA單堿基編輯器都取得了重要發展。

DNA堿基編輯器

DNA堿基編輯器分為嘧啶堿基編輯器(cytosine base editors, CBEs)和嘌呤堿基編輯器(adenine base editors, ABEs)兩種類型，分別適用于C/G到T/A和A/T到G/C的堿基對轉變。CBEs 和 ABEs工作原理如圖2所示，DNA堿基編輯器是向活細胞中引入永久性DNA點突變的有效工具。

圖2. DNA堿基編輯技術概述^[3-4] a. 嘧啶堿基編輯器機制；b. 嘌呤堿基編輯器機制。

RNA堿基編輯器

RNA堿基編輯器分為A到I堿基編輯器和C到U堿基編輯器，并根據其引入的修飾進一步細分。與DNA堿基編輯器不同，這些修飾在轉錄本的生命期內不會被細胞進一步處理。RNA堿基編輯器工作原理如圖3所示。

[5-8] a-c. A到I RNA堿基編輯；d. C到U RNA堿基編輯

大顯身手，多領域應用嶄露頭角

• 人類疾病治療的研究

2020年10月19日，加州大學歐文分校的研究人員在 Nature子刊 Nature Biomedical Engineering 雜志發表了題為：Restoration of visual function in adult mice with an inherited retinal disease via adenine base editing 的研究論文[9]。該研究使用慢病毒載體遞送腺嘌呤單堿基編輯器（ABE），實現了對先天性黑蒙癥小鼠模型突變基因的高效修復，有效恢復了小鼠模型視覺能力，且未發現可檢測的脫靶效應。這項工作表明，單堿基編輯技術在某些情況下可能會替代基因增強療法，以永久挽救因突變而失能的關鍵蛋白的功能，或修正無法使用基因增強療法的顯性遺傳病。這項工作也代表了治療遺傳性視網膜疾病的新方向。

2020年10月19日，加州大學歐文分校的研究人員在 Nature子刊 Nature Biomedical Engineering 雜志發表了題為：Restoration of visual function in adult mice with an inherited retinal disease via adenine base editing 的研究論文[9]。該研究使用慢病毒載體遞送腺嘌呤單堿基編輯器（ABE），實現了對先天性黑蒙癥小鼠模型突變基因的高效修復，有效恢復了小鼠模型視覺能力，且未發現可檢測的脫靶效應。這項工作表明，單堿基編輯技術在某些情況下可能會替代基因增強療法，以永久挽救因突變而失能的關鍵蛋白的功能，或修正無法使用基因增強療法的顯性遺傳病。這項工作也代表了治療遺傳性視網膜疾病的新方向。

• 動物模型開發

韓國首爾大學Jin-Soo Kim組率先發表了將 rAPOBEC-XTEN-Cas9n-UGI( BE3) 系統運用于小鼠疾病模型制備的研究成果^［11］。針對小鼠抗肌萎縮蛋白基因Dmd設計sgRNA，通過顯微注射小鼠受精卵，得到9只F0代小鼠中，有5只小鼠產生了靶位點的堿基突變，包括一只純合子突變小鼠( CAG＞TAG） ；針對小鼠酪氨酸酶基因Tyr設計sgRNA，通過電轉染方法，得到7只F0后代小鼠中均檢測到靶基因突變，包括3只純合子Tyr突變小鼠。中山大學黃軍就組也利用單堿基編 輯系統研究了該技術在制備小鼠疾病模型中的效率^［12］。并首次報道了在小鼠胚胎中由堿基編輯系統誘導產生的靶位點處的堿基插入以及臨近位點的脫氨基。

• 作物改良育種

中科院的高彩霞團隊率先將單堿基編輯技術應用于三大重要農作物小麥、水稻和玉米的性狀改良上，并且取得了重大進展^［13］。高教授團隊構建了密碼子優化的 rAPOBEC1-XTEN-dCas9n-UGI 和 rAPOBEC1-XTEN-dCas9-UGI 兩種融合蛋白，通過針 對三大農作物共 7 個基因位點進行單堿基編輯實驗，發現選用 Cas9n 可以獲得較高的單堿基編輯效率。同期中科院上海生命科學研究院的朱健康團隊和中國農業科學院作物研究所的夏蘭琴團隊也分別報道了利用單堿基編輯系統對水稻基因進行單堿基編輯^{［14, 15］}。單堿基編輯系統可以在農作物中取得高效的編輯效率，為改良作物品種帶來新希望。^[16]

相關服務

本研究中使用的引物池由金斯瑞合成。引物池合成服務一次性合成多達91,766條引物，序列覆蓋率99%以上，堿基單價低至1分錢，讓您不再為預算和周期而煩惱，專心進行合成生物學研究、靶向測序及復合DNA文庫實驗等，將您的所有科研設想變成現實。

參考資料

• Landrum, M. J. et al. ClinVar: public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Res. 44, D862–D868 (2016)
• 羅舒蕾. 單堿基編輯技術的研究進展[J]. 當代化工研究, 2020(5).
• Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420–424 (2016).
• Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A?T to G?C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464–471 (2017).
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• 劉佳慧, 梁普平, 時光, et al. 單堿基基因編輯系統的研究進展 [J]. 世界科技研究與發展, 2017, 039(006):457-462.