背景介紹
客戶需在酵母中構建了一個四基因代謝途徑，將底物轉化為小分子藥物前體。 前期將四個基因非別置于四個組成型啟動子的控制之下，然后將整個途徑置于酵母菌株的低拷貝數質粒中，但最終構建的菌株的目標前體產量遠達不到商業化生產水平。 為提高產量，客戶決定在保證啟動子不變的情況下針對每個催化反應的酶進行優化。
客戶要求在低拷貝數載體中構建分別由四個組成型啟動子啟動的四基因代謝途徑。 為了提高產量，優化合成通路，通過檢索數據庫和文獻查找到每種基因的五十種變體。隨機將這些基因變體插入該途徑的每個編碼DNA序列（CDS）位置，理論上形成的文庫大小為6250000。
將所有突變體DNA片段和載體骨架片段放入一個組裝反應體系中進行組裝，然后轉化E. coil細胞形成一個混合文庫。 隨機挑選2,000個單菌落并PCR驗證四個目的基因片段是否成功插入，結果顯示陽性率超過80％。 將所有PCR檢測結果為陽性的克隆經過培養后均采用高通量平臺進行小量制備，然后將質粒轉化至酵母細胞中以進行性能測試和篩選。
隨機挑選48個陽性克隆進行測序分析， 測序結果顯示文庫多樣性達100％且文庫組裝的偏差性很小。
篩選所有陽性克隆的性能后，選取性能最好的96個克隆進行測序。 在性能良好的克隆中，某些基因變體的富集度明顯高于其他變體。 這些性能表現良好的變體可以在下一輪優化中進一步進行組合測試。
